冀建偉，付蕾，鄭鵬遠(yuǎn)，張軍（.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州45004；.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州45000）

雙歧桿菌對應(yīng)激模型大鼠腸道通透性的影響Δ

冀建偉1＊，付蕾2，鄭鵬遠(yuǎn)1#，張軍1（1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450014；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州450001）

目的：研究雙歧桿菌對應(yīng)激模型大鼠腸道通透性的影響及其與蒙脫石散聯(lián)用的協(xié)同作用。方法：取SD大鼠50只隨機(jī)均分為正常對照組、模型對照組、雙歧桿菌干預(yù)組（2×108cfu）、蒙脫石散干預(yù)組（0.6g·kg－1）及其聯(lián)合干預(yù)組（雙歧桿菌2×108cfu+蒙脫石散0.6g·kg－1），每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7d，后4組每日給藥后以避水壓力模型（WAS）方法建立大鼠應(yīng)激模型。第8天各組分別灌胃給予探針?biāo)幬锔事洞?0mg、三氯蔗糖60mg，檢測各組大鼠給藥后5、24h尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量及其比值，以評(píng)價(jià)腸道通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，檢測各組大鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的含量。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組大鼠24h尿液中甘露醇的量及血清中CRF、ACTH含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，雙歧桿菌干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組ACTH含量均明顯降低（P＜0.05），其余指標(biāo)均有降低，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：雙歧桿菌對應(yīng)激模型大鼠的腸道通透性有影響，其與蒙脫石散聯(lián)用對應(yīng)激所致的腸道屏障功能紊亂無協(xié)同作用。

雙歧桿菌；應(yīng)激模型；大鼠；腸道通透性；蒙脫石散

益生菌是人類腸道的原籍菌，在維持宿主胃腸道正常生理功能中發(fā)揮著重要作用。雙歧桿菌是人類腸道最早發(fā)現(xiàn)的益生菌，極具研究價(jià)值。盡管大量的數(shù)據(jù)顯示，益生菌能夠調(diào)節(jié)腸道免疫[1]、阻滯病原菌黏附、提高黏膜屏障功能[2，3]，但其在應(yīng)激所致的腸道屏障功能紊亂中的治療作用研究較少。蒙脫石散是臨床上常用的腸道黏膜屏障保護(hù)劑，是一種特有的不吸收、不會(huì)造成全身性不良反應(yīng)，且應(yīng)用方便、經(jīng)濟(jì)的口服制劑。蒙脫石散在維持腸道黏膜機(jī)械屏障、穩(wěn)定腸道微生態(tài)環(huán)境等方面可發(fā)揮重要作用，能夠有效地預(yù)防和控制腸道病原菌生物移位的發(fā)生。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者擬以避水壓力模型（WAS）方法模擬環(huán)境和心理壓力建立應(yīng)激模型大鼠，研究雙歧桿菌對應(yīng)激模型大鼠腸道通透性的影響及其與蒙脫石散聯(lián)用是否具有協(xié)同作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spectra MR型酶標(biāo)儀（美國Dynex公司）；Agilent 6890N氣相色譜儀（美國Agilent科技有限公司）。

1.2 試藥

蒙脫石散（博福-益普生（天津）制藥有限公司，批號(hào)：T0461，規(guī)格：每袋3g）；大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒（美國ADL公司）；甘露醇（比利時(shí)Acros公司，純度：98%）；三氯蔗糖（純度：99%）、α-D-甲基甘露糖苷（內(nèi)標(biāo)1，純度：99%）、蔗糖（內(nèi)標(biāo)2，純度：99%）均由美國Sigma公司提供。

1.3 益生菌

雙歧桿菌（鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué)研究所，分離自內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片）。

1.4 動(dòng)物

SD大鼠，♀，清潔級(jí)，體重（200±20）g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK（豫）2005-0001。

2 方法

2.1 分組與給藥

取大鼠50只，隨機(jī)均分為正常對照組（生理鹽水2mL）、模型對照組（生理鹽水2mL）、雙歧桿菌干預(yù)組（2×108cfu）、蒙脫石散干預(yù)組（0.6g·kg－1）及其聯(lián)合干預(yù)組（雙歧桿菌2×108cfu+蒙脫石散0.6g·kg－1），每日上午8：00灌胃給予相應(yīng)藥物1次，連續(xù)給藥7d。

2.2 建模

采用WAS方法。每日稱重、給藥后，除正常對照組外其余各組大鼠均放置于一個(gè)8cm×6cm的平臺(tái)上，平臺(tái)固定在一個(gè)直徑50cm、深50cm的有水塑料容器內(nèi)，離水面的距離為1cm[2]，每次放置2h（上午8：00－10：00）。

2.3 腸道通透性測定

本實(shí)驗(yàn)以大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量及其比值來評(píng)價(jià)其腸道通透性。

2.3.1 糖攝取與尿液采集。實(shí)驗(yàn)第8天上午8：00，各組大鼠分別灌胃給予探針?biāo)幬锔事洞?0mg、三氯蔗糖60mg，然后放入大鼠代謝籠，3h后自由飲水，整個(gè)過程中禁食[4]。收集給藥后5h及其后19h尿液，記錄尿液體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將采集到的尿液置于－20℃條件下儲(chǔ)存，待測。

2.3.2 樣品的制備。取給藥后5h及其后19h尿液各100μL，分別加入20μL混合內(nèi)標(biāo)溶液（含5mg·mL－1內(nèi)標(biāo)1與2mg·mL－1內(nèi)標(biāo)2），混勻后70℃下氮?dú)獯蹈桑稍镂锛尤?00μL含25mg·mL－1鹽酸羥胺的無水吡啶溶液，70℃反應(yīng)1h后，2250r·min－1離心5min，取100μL上清液至小錐形瓶中，加入100μL N-三甲硅烷基咪唑，70℃反應(yīng)30min，將得到含硅烷化衍生物的尿液密封儲(chǔ)存于－20℃冰箱中，待測。另向正常健康大鼠的空白尿液中加入已知量的混合探針?biāo)幬镏瞥蓸?biāo)準(zhǔn)品（高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品）進(jìn)行平行分析。

2.3.3 色譜條件。色譜柱：HP-5（5%苯甲基硅烷）柱（30m×320μm，0.25μm）；載氣：氮?dú)猓魉伲?.0mL·min－1；柱溫[5]：程序升溫，初始溫度220℃，保持5min，然后以10℃·min－1升溫2min，5℃·min－1升溫4min，3.5℃·min－1升溫4min后達(dá)到最終溫度274℃，保持7min，整個(gè)操作時(shí)間為22min；檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；檢測器溫度：280℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；手動(dòng)進(jìn)樣；進(jìn)樣量：2μL。同時(shí)檢測甘露醇和三氯蔗糖的量。每種糖的含量由相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間（tR）來確定，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中每種糖的量，甘露醇的量：m甘/m內(nèi)標(biāo)1＝A甘/A內(nèi)標(biāo)1，三氯蔗糖的量：m三/m內(nèi)標(biāo)2＝A三/A內(nèi)標(biāo)2。式中，m甘：甘露醇的質(zhì)量，m內(nèi)標(biāo)1：內(nèi)標(biāo)1的質(zhì)量，A甘：甘露醇的峰面積，A內(nèi)標(biāo)1：內(nèi)標(biāo)1的峰面積，m三：三氯蔗糖的質(zhì)量，m內(nèi)標(biāo)2：內(nèi)標(biāo)2的質(zhì)量，A三：三氯蔗糖的峰面積，A內(nèi)標(biāo)2：內(nèi)標(biāo)2的峰面積。在上述色譜條件下，內(nèi)標(biāo)1、甘露醇、內(nèi)標(biāo)2、三氯蔗糖的保留時(shí)間分別是3.5、4.6、13.7、14.6min。

2.3.4 系統(tǒng)適用性與方法學(xué)研究。在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下，甘露醇峰和三氯蔗糖峰與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于6000，拖尾因子在0.95～1.05之間，RSD小于2%。甘露醇檢測濃度在0.5～20mg·mL－（1r＝0.999，n＝8）、三氯蔗糖檢測濃度在0.05～2mg·mL－（1r＝0.998，n＝8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。日內(nèi)、日間RSD均小于10%，相對回收率均大于90%。

2.4 血清中CRF、ACTH含量的檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束日處死大鼠，收集各組大鼠血液，室溫下凝固20min，4℃、4000r·min－1離心30min，分離血清，采用CRF、ACTH ELISA試劑盒測定各組大鼠血清中CRF和ACTH的含量，以確定大鼠是否產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 腸道通透性指標(biāo)

給藥后5h，各組大鼠腸道通透性指標(biāo)比較無顯著性差異。與正常對照組比較，模型對照組大鼠給藥后24h尿液中甘露醇的量明顯升高（P＜0.05），表明應(yīng)激條件下大鼠腸道通透性增強(qiáng)。各組大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量見表1。

表1 各組大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量比較（mgn＝10）Tab 1Comparison of the amount of mannitol and sucralose in urin（emg

表1 各組大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量比較（mgn＝10）Tab 1Comparison of the amount of mannitol and sucralose in urin（emg

與正常對照組比較：＊P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05

給藥后5h三氯蔗糖4.198±0.3123.700±0.3533.619±0.2683.645±0.3063.625±0.298組別正常對照組模型對照組雙歧桿菌干預(yù)組蒙脫石散干預(yù)組聯(lián)合干預(yù)組甘露醇1.849±0.2062.163±0.2761.996±0.1882.030±0.2941.924±0.309三氯蔗糖1.780±0.1911.987±0.2291.837±0.2701.870±0.3131.862±0.225給藥后24h甘露醇3.774±0.3194.078±0.362＊3.802±0.2903.861±0.3353.845±0.296

3.2 血清中CRF、ACTH含量變化

與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中CRF、ACTH含量均明顯升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，雙歧桿菌干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組大鼠血清中ACTH含量均明顯降低（P＜0.05）。表明在應(yīng)激條件下，大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌處于應(yīng)激狀態(tài)，而雙歧桿菌對這種應(yīng)激狀態(tài)有緩解作用。各組大鼠血清中CRF、ACTH含量比較見表2。

表2 各組大鼠血清中CRF、ACTH含量比較（pg·L－1n＝10）Tab 2Comparison of serum levels of CRF and ACTH in each grou（ppg·L－1

表2 各組大鼠血清中CRF、ACTH含量比較（pg·L－1n＝10）Tab 2Comparison of serum levels of CRF and ACTH in each grou（ppg·L－1

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型對照組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model control group：#P＜0.05

項(xiàng)目CRF ACTH組別聯(lián)合干預(yù)組277.8±31.95.94±0.650#正常對照組267.0±32.35.68±0.799模型對照組300.8±34.3＊6.79±0.651＊雙歧桿菌干預(yù)組279.5±29.65.92±0.477#蒙脫石散干預(yù)組281.6±32.36.24±0.787

4 討論

近年來，社會(huì)心理因素對壓力相關(guān)性（Stress-associated）疾病如肥胖、代謝綜合征、2型糖尿病以及疼痛和慢性疲勞綜合征的影響日益受到關(guān)注[6，7]。越來越多的學(xué)者認(rèn)為生活壓力能夠?qū)е禄蚣又毓δ苄阅c病如腸易激綜合征（IBS）[8，9]以及炎癥性腸?。↖BD）如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎[9，10]。IBS是一種最常見的消化系統(tǒng)功能性疾病，近年的發(fā)病率亦逐年升高。研究[11]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激刺激能夠影響胃腸道的蠕動(dòng)、分泌等功能，并且可以增加旁細(xì)胞途徑的滲透，而IBS和IBD患者大多存在腸道屏障功能紊亂。腸道通透性測定是評(píng)估腸道屏障完整性最直接、準(zhǔn)確的方法。腸道通透性可以通過測定口服攝入大分子探針?biāo)幬镌谀蛞褐械呐判箒硗瓿蒣12]。應(yīng)用最廣泛的探針?biāo)幬锸翘穷惢衔?，如蔗糖、甘露醇、乳果糖等。其中，口服甘露醇和三氯蔗糖在胃腸道的不同部位被較少吸收，大部分以原型通過糞便排泄，其余以原型從尿液排泄[13]。因此，口服一定量的糖探針溶液，并測定其在尿液中的排泄量，就可以選擇性地反映胃腸道不同位置的屏障完整性。乳果糖與甘露醇比例曾是許多科研和臨床研究中評(píng)估小腸通透性的重要工具。但由于乳果糖易被結(jié)腸細(xì)菌分解，改變結(jié)腸pH并可能改變結(jié)腸微生物群、改變腸道通透性，因此不宜選用。三氯蔗糖是蔗糖氯化后的一種人工合成二糖，其不僅對熱穩(wěn)定，而且在通過整個(gè)消化道時(shí)幾乎不被代謝，并且與蔗糖和乳果糖有相似的分子量。因此本實(shí)驗(yàn)選用甘露醇和三氯蔗糖作為檢測大鼠腸道通透性的探針?biāo)幬铩?/p>

毛細(xì)管氣相色譜法（CCGC）是一種研究腸道通透性的新方法，具有實(shí)用、可重復(fù)、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用CCGC法，2種糖都能在相同條件下同時(shí)檢測，降低了誤差。筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)由于甘露醇與三氯蔗糖在CCGC中tR相差較大（＞8），因此選擇了雙內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定。在本實(shí)驗(yàn)中，24h大鼠排泄的三氯蔗糖和甘露醇幾乎一半出現(xiàn)在了5h尿液中，另外一半出現(xiàn)在后19h的尿液中。一般認(rèn)為前5h為糖探針通過小腸以上胃腸道特別是小腸的時(shí)間，而后19h則代表其通過大腸特別是結(jié)腸的時(shí)間[14]。本實(shí)驗(yàn)中，與正常對照組比較，應(yīng)激模型大鼠前5h的腸道通透性無變化，而24h的腸道通透性發(fā)生改變，說明WAS應(yīng)激可能對結(jié)腸的通透性影響較大。

應(yīng)激模型大鼠出現(xiàn)腸道通透性的改變可能與CRF有關(guān)。筆者前期體外研究顯示腸黏膜嗜酸細(xì)胞在SP（Substance P）的作用下可以產(chǎn)生并釋放CRF[15]，而使用CRF受體阻滯藥可以顯著改善應(yīng)激所導(dǎo)致的腸道屏障功能紊亂[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)激模型大鼠出現(xiàn)腸道通透性改變，血清中CRF、ACTH含量明顯升高，而雙歧桿菌干預(yù)組和聯(lián)合干預(yù)組的ACTH含量明顯降低，且接近正常對照組，說明應(yīng)激能夠?qū)е麓笫笊窠?jīng)內(nèi)分泌紊亂，而雙歧桿菌對應(yīng)激模型大鼠的腸道通透性有影響。但應(yīng)激模型大鼠出現(xiàn)腸道屏障功能紊亂與CRF之間的具體關(guān)系目前尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

與雙歧桿菌干預(yù)組和蒙脫石散干預(yù)組比較，聯(lián)合干預(yù)組大鼠的腸道通透性指標(biāo)血清中CRF、ACTH含量均無顯著性差異，說明雙歧桿菌與蒙脫石散聯(lián)用對應(yīng)激所致的腸道屏障功能紊亂無協(xié)同作用。

[1] 張利利，鄭鵬遠(yuǎn)，羅 予，等.雙歧桿菌對食物過敏小鼠腸道屏障功能及Th1/Th2細(xì)胞因子的影響[J].世界華人消化雜志，2009，17（11）：1091.

[2] Zareie M，Johnson-Henry K，Jury J，et al.Probiotics prevent bacterial translocation and improve intestinal barrier function in rats following chronic psychological stress[J].Gut，2006，55（11）：1553.

[3] Gareau MG，Jury J，MacQueen G，et al.Probiotic treatment of rat pups normalises corticosterone release and ameliorates colonic dysfunction induced by maternal separation[J].Gut，2007，56（11）：1522.

[4] Meddings JB，Gibbons I.Discrimination of site-specific alterations in gastrointestinal permeability in the rat[J].Gastroenterology，1998，114（1）：83.

[5] Farhadi A，Keshavarzian A，Holmes EW，et al.Gas chromatographic method for detection of urinary sucralose：application to the assessment of intestinal permeability[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2003，784（1）：145.

[6]Miller G，Chen E，Cole SW.Health psychology：developing biologically plausible models linking the social world and physical health[J].Annu Rev Psychol，2009，60：501.

[7] Muscatell KA，Slavich GM，Monroe SM，et al.Stressful life events，chronic difficulties，and the symptoms of clinical depression[J].J Nerv Ment Dis，2009，197（3）：154.

[8] Santos J，Alonso C，Vicario M，et al.Neuropharmacology of stress-induced mucosal inflammation：implications for inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome[J].Curr Mol Med，2008，8（4）：258.

[9] Stengel A，Taché Y.Neuroendocrine control of the gut during stress：corticotropin-releasing factor signaling pathways in the spotlight[J].Annu Rev Physiol，2009，71：219.

[10] Maunder RG，Levenstein S.The role of stress in the development and clinical course of inflammatory bowel disease：epidemiological evidence[J].Curr Mol Med，2008，8（4）：247.

[11] Mazzon E，Sturniolo GC，Puzzolo D，et al.Effect of stress on the paracellular barrier in the rat ileum[J].Gut，2002，51（4）：507.

[12] O’Brien DP，Nelson LA，Kemp CJ，et al.Intestinal permeability and bacterial translocation are uncoupled after small bowel resection[J].Pediatr Surg，2002，37（3）：390.

[13] Johnston SD，Smye M，Watson RP.Intestinal permeability tests in coeliac disease[J].Clin Lab，2001，47（3-4）：143.

[14] Anderson AD，Jain PK，F(xiàn)leming S，et al.Evaluation of a triple sugar test of colonic permeability in humans[J].Acta Physiol Scand，2004，182（2）：171.

[15] Zheng PY，F(xiàn)eng BS，Oluwole C，et al.Psychological stress induces eosinophils to produce corticotrophin releasing hormone in the intestine[J].Gut，2009，58（11）：1473.

[16]Teitelbaum AA，Gareau MG，Jury J，et al.Chronic peripheral administration of corticotropin-releasing factor causes colonic barrier dysfunction similar to psychological stress[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，295（3）：G452.

Influence of Bifidobacterium on the Intestinal Permeability in Stress Model Rats

JI Jian-wei，ZHENG Peng-yuan，ZHANG Jun（The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014，China）
FU Lei（School of Pharmacy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

OBJECTIVE：To study the improvement effect of Bifidobacterium on intestinal permeability in stress model rats，and synergistic reaction of Bifidobacterium combined with Montmorillonite powders.METHODS：50SD rats were randomly divided into normal control group，model control group，Bifidobacterium treatment group（2×108cfu），Montmorillonite powders treatment group（0.6g·kg－1）and drug combination group（Bifidobacterium 2×108cfu+Montmorillonite powders 0.6g·kg－1）.Those rats were given medicine once a day via i.g.for consecutive 7days.Stress model was established by WAS in the latter 4groups.On 8th day each group was given mannitol 80mg and sucralose 60mg，and the amount and ratio of mannitol and sucralose in urine were determined 5h and 24h after administration to evaluate intestinal permeability.Rats were sacrificed at the end of experiment，and the content of corticotrophin releasing factor（CRF）and adrenocorticotrophic hormone（ACTH）in serum were determined.RESULTS：Compared with normal control group，the 24h mannitol concentration，the serum levels of CRF and ACTH in model control group increased significantly（P＜0.05）.Compared with model control group，serum levels of ACTH in Bifidobacterium treatment group and drug combination group decreased significantly（P＜0.05）.Other parameters all decreased but had no statistical significance.CONCLUSION：Bifidobacterium can improve intestinal permeability of stress model rats，protect intestinal mucosa.In the treatment of intestinal dysfunction caused by chronic psychological stress，Bifidobacterium and Montmorillonite powders are not in synergies.

Bifidobacterium；Stress model；Rats；Intestinal permeability；Montmorillonite powders

R965

A

1001-0408（2012）17-1543-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.17.03

Δ國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30772028）

＊藥師。研究方向：消化系統(tǒng)藥物臨床合理應(yīng)用。電話：0371-63974693。E-mail：jiwei_2002@163.com

#通訊作者：教授，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：消化系統(tǒng)藥物臨床合理應(yīng)用。電話：0371-63974693

2011-05-16

2011-08-04）