張遠(yuǎn)冬 張有金 郭延壘 劉學(xué)慶 于超

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)亦稱血清素(Serotonin)，是人體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其參與睡眠、攝食、體溫、學(xué)習(xí)、記憶等多種生理過程［1］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT含量異常與重性抑郁障礙(major depressive disorder，MDD)和自殺行為有著極其重要的聯(lián)系［2，3］，同時(shí)也可以影響血腦屏障通透性的改變［4］。因此定量測(cè)定5-HT在腦組織中的含量對(duì)精神情感性疾病、腦血管疾病等的發(fā)病機(jī)制的研究具有重要參考價(jià)值。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，5-HT含量測(cè)定的方法有生物法、免疫法［5，6］、熒光分光光度法［7］、高效液相-電化學(xué)色譜法(HPLCECD)、高效液相-熒光色譜法(HPLC-FLD)、高效液相-紫外色譜法(HPLC-UV)等［8］。目前，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究中都采用準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)便快速的液相色譜法，其中，HPLC-UV法以其儀器成本較低、操作簡(jiǎn)單、維護(hù)簡(jiǎn)便，因而在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較為廣泛，使用頻率大大高于HPLC-ECD和HPLC-FLD。此外，HPLC-UV法常用于血清中5-HT含量的測(cè)定，但對(duì)于大鼠腦組織中5-HT含量的測(cè)定鮮有報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV法，建立了快速穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠的測(cè)定大鼠腦組織中5-HT含量的方法，為5-HT等相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)類疾病的臨床研究提供重要參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀(SHIMADZU LC-2010AHT);Z233MK型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)HEMNLE公司);3240025組織勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司);XS-105十萬分之一精密電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);SB-3200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝公司);SEVEN Multi PH計(jì)(瑞士METTLER TOLEDO公司);Elix10超純水凈化系統(tǒng)(美國(guó)MILLIPOER公司);01730微孔過濾器(美國(guó)MILLIPORE公司)。

鹽酸-5-羥色胺(Serotonin hydrochloride，美國(guó) SIGMAALORICH公司，批號(hào):H9523-25MG);甲醇為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)，水為超純水，其他試劑均為市售分析純。

1.2 色譜條件 色譜柱為SHIMADZU VP-ODS C18柱(250×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol/L的醋酸鉀緩沖液(10:90，V/V，用0.2 mol/L檸檬酸調(diào)pH至4.00)等度洗脫，柱溫:25℃，流速:1.00 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品1.480 mg于容量瓶中，加超純水溶解并定容，制成1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，避光，-20℃冷藏保存。按實(shí)際檢測(cè)需要稀釋到相應(yīng)的濃度，供檢測(cè)用。

1.4 樣品來源及制備 清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠5只，每只平均體重為200±20 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格許可證號(hào)為SCXK(渝):2007-0002。

大鼠斷頭處死后取整個(gè)腦組織，稱濕重，以1∶15加入PBS(1 mol/L磷酸氫二鉀:1 mol/L磷酸二氫鉀=80:20混合)，于冰浴中充分勻漿后混勻。為選擇合適的蛋白沉淀劑，將勻漿液分為三份，分別加入勻漿液體積一半量的乙腈、10%三氯乙酸、10%高氯酸沉淀蛋白。充分渦旋后，在4℃下以12000 rpm離心15 min后精密吸取上清液200 μl，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0，過0.45 μm濾膜后于 -80℃保存待測(cè)

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 為確定流動(dòng)相的最適pH值，分別考察了醋酸鉀緩沖液pH值在5.00、4.50、4.00時(shí)的色譜峰峰形及峰高，結(jié)果如圖1所示，pH在5.00和4.50時(shí)，峰形較寬，且有嚴(yán)重拖尾，當(dāng)pH為4.00時(shí)，峰型良好，拖尾得到了良好的改善，因此確定緩沖液pH為4.00，與甲醇比例為90:10(V/V)進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果如圖2所示，5-HT峰形良好，且無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，其保留時(shí)間為9.3 min。

2.2 線性范圍與最低檢測(cè)限 精密量取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液各20 μl，分別加入超純水稀釋，配成濃度為 0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在此色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以面積A為縱坐標(biāo)(Y)，以濃度C(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 A =46008.89C +1886.58(r=0.9999)，表明5-HT 在0.1 ～20 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適合于5-HT含量的測(cè)定;5-HT的最低檢測(cè)限(LOD)為40 ng/ml(S/N＞3)。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μl，分別加超純水稀釋，制成高、中、低三種濃度為7.5、1.5、0.15 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μl，于第1 d各測(cè)定5次，每次進(jìn)樣20 μl，計(jì)算當(dāng)日內(nèi)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察日內(nèi)精密度;同時(shí)連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算3 d內(nèi)峰面積RSD，考察日間精密度。結(jié)果如表1所示，各濃度的日內(nèi)、日間RSD均小于3%;表明此實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察 精密量取5-HT標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μl，制成高、中、低3 種濃度為7.5、1.5、0.15 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液800 μl，平行制備兩組，一組置于室溫保存，另一組置于-20℃保存，并于第1、2、3、5、7天連續(xù)進(jìn)樣，每日各測(cè)定5 次，記錄峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得測(cè)定濃度，計(jì)算一周內(nèi)所測(cè)濃度的RSD，考察5-HT的穩(wěn)定性。結(jié)果如表2及表3所示，室溫和凍融實(shí)驗(yàn)下5-HT各濃度RSD均小于3%;說明5-HT在室溫和凍融試驗(yàn)中均較穩(wěn)定，易于保存。

2.5 加樣回收率考察 精密吸取未經(jīng)蛋白沉淀處理的大鼠腦組織勻漿液3份，再精密加入特定體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制成含標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.19、0.16、0.13 μg/ml的待測(cè)液溶液各200 μl，每一濃度平行制備3組，每組重復(fù)測(cè)定5次，考察其加樣回收率。按公式:回收率=(測(cè)定液測(cè)定值-原樣液含測(cè)值)/加入量值×100%，計(jì)算大鼠腦組織中5-HT加樣回收率。結(jié)果如表4所示，所測(cè)得范圍為89.62% ～101.6%，符合生物樣品測(cè)定要求，說明此色譜條件下所測(cè)得的5-HT含量準(zhǔn)確度較好。

圖1 不同pH值下的5-HT色譜圖

圖2 5-HT色譜圖

表1 日內(nèi)、日間精密度考察結(jié)果(n=5)

表2 室溫穩(wěn)定性(n=5)

表3 凍融穩(wěn)定性(n=5)

表4 5-HT加樣回收率(n=5)

2.6 樣品含量的測(cè)定 取大鼠腦組織樣品，按“1.4”項(xiàng)下方法操作，平行制備3組，并在此色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，照外標(biāo)法計(jì)算，測(cè)得該組織樣品中5-HT含量為(0.2715±28)μg/g。

3 討論

在以往研究中，5-HT的含量測(cè)定方法眾多，其中，免疫法實(shí)驗(yàn)條件要求高;熒光分光光度法操作復(fù)雜，數(shù)據(jù)讀取時(shí)誤差大，故其應(yīng)用均受到較大限制;HPLC-ECD、HPLC-FLD、HPLC-UV法現(xiàn)已是國(guó)內(nèi)外測(cè)定5-HT較為常用的方法。前二者雖然靈敏度高，但HPLC-ECD法測(cè)定時(shí)，儀器系統(tǒng)在分析前對(duì)樣品進(jìn)行鈍化要求高［9］，電化學(xué)工作電極容易受污染且其樣品極易受其他物質(zhì)干擾，需嚴(yán)格控制測(cè)定過程來減少干擾［10］;同時(shí)其流動(dòng)相組成常含有高濃度離子對(duì)試劑，對(duì)柱子傷害較大。而在HPLC-FLD法中，同樣由于檢測(cè)器成本昂貴，大大限制了其使用。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV法，建立了穩(wěn)定快速的大鼠腦組織中5-HT的含量測(cè)定方法，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于臨床和科研對(duì)5-HT大樣本量的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)［11］的基礎(chǔ)上，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了流動(dòng)相比例、pH值、離子強(qiáng)度等的優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-HT色譜峰在流動(dòng)相為4.00時(shí)峰形良好，且無內(nèi)源性物質(zhì)的干擾;在流動(dòng)相的配制上，選用10 mmol/L的醋酸鉀溶液，并以0.20 mol/L的檸檬酸調(diào)節(jié)pH至4.00的方法，降低了緩沖鹽離子強(qiáng)度，減小了緩沖鹽體系對(duì)柱子的損傷程度。

在樣品制備過程中，本文進(jìn)行了蛋白沉淀試劑的優(yōu)化，比較了乙腈、10%三氯乙酸、10%高氯酸的蛋白沉淀效果。發(fā)現(xiàn)乙腈和10%的三氟乙酸沉淀蛋白時(shí)均出現(xiàn)嚴(yán)重的干擾峰，而10%的高氯酸沉淀時(shí)無蛋白峰干擾，且5-HT色譜峰峰形良好。由于高氯酸有很強(qiáng)的氧化性，對(duì)柱子損害較大，因此進(jìn)樣前需調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至7.0左右，以降低其對(duì)分析柱的損傷。

［1］林凌云，李慧，許崇濤，等.HPLC-熒光法測(cè)定大鼠腦組織中的單胺類神經(jīng)遞制質(zhì)及相關(guān)物質(zhì).華西藥學(xué)雜志，2007，22(5):557-558.

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