游玟娟，溫?fù)碥?/p>

(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲，412004)

五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill)為木蘭科植物五味子干燥成熟果實(shí)，可分為北五味子和南五味子2種。五味子中含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、維生素、木脂素、三萜、倍半萜及多糖等多種化學(xué)成分［1］。研究表明［2－5］，五味子多糖具有促進(jìn)免疫、抗腫瘤、抗氧化和抗衰老等多種藥理作用和功效。

超聲波技術(shù)主要利用超聲產(chǎn)生的“空化”效應(yīng)，使細(xì)胞破裂，具有穿透力強(qiáng)，成本低，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)［6］，因此近年來(lái)在天然產(chǎn)物成分提取領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。本文采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲輔助乙醇提取北五味子多糖工藝條件，并對(duì)北五味子多糖抗氧化性能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

北五味子，購(gòu)于株洲市千金大藥房。

葡萄糖，3，5-二硝基水楊酸，鎢酸鈉，酒石酸鉀鈉，NaOH，結(jié)晶酚，亞硫酸鈉，乙醚，乙酸，石油醚，三氯甲烷等，均為分析純

HH.SYH-Ni2-C水浴鍋(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，DHG－9140A型干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);LDZ4－0.8A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，UV－9100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)，SB－5200超聲波清洗器(上海新芝生物技術(shù)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 北五味子干粉的制備

將北五味子洗凈后，置于80℃烘箱中烘干后粉碎，過(guò)80目篩，備用。

1.2.2 北五味子多糖測(cè)定方法

相應(yīng)的特征方程為根為r1=0.92，r2,3=-0.21±0.30i,由引理3,原差分方程的解即所求概率為

采用DNS法［7］進(jìn)行測(cè)定。取1g北五味子干粉，按1∶25加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，置于功率設(shè)定為200 W的超聲波清洗器中，在溫度為60℃條件下提取40 min，小心倒出上清液，重新添加70%乙醇，重復(fù)提取5次，收集所有提取液，置于4 000 r/min離心機(jī)中離心10 min，取上清液適當(dāng)稀釋，按DNS法測(cè)540 nm處吸光值(A)。以吸光值對(duì)應(yīng)的多糖量乘以稀釋倍數(shù)，除以樣品的質(zhì)量，即得到北五味子總多糖。各實(shí)驗(yàn)條件下提取的多糖量按如下公式計(jì)算:

多糖量/(mg·g－1)(以葡萄糖計(jì))=(c× D ×V/m)×0.9

式中:c為被測(cè)液A值所對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中葡萄糖濃度(mg/mL);D為稀釋倍數(shù);V為樣品液總體積(mL);m為投加的五味子干粉質(zhì)量(g)。

1.2.3 北五味子多糖提取條件優(yōu)化方法

單因素實(shí)驗(yàn)提取劑選用乙醇、乙酸、石油醚、氯仿、水5個(gè)水平;乙醇體積分?jǐn)?shù)采用 30%、40%、50%、60%、70%5 個(gè)水平;提取溫度為 40、50、60、70、80℃5 個(gè)水平;提取料液比(g∶mL)采用 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 五個(gè)水平;提取時(shí)間采用 30、40、50、60、70 min 5個(gè)水平。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)提取率影響顯著的3個(gè)因素，運(yùn)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化。

1.2.4 北五味子多糖抗氧化性能測(cè)定方法

分別測(cè)定北五味子多糖提取液對(duì)·OH、O－2·清除效果，評(píng)價(jià)其抗氧化性能?！H自由基清除率采用賈之慎［7］等Fenton體系比色法進(jìn)行測(cè)定·清除率采用宋慧［8］等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及總多糖含量測(cè)定結(jié)果

以葡萄糖濃度為為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，回歸方程為:y=0.403 9x－0.006 4，R2=0.998 8，式中 x為葡萄糖濃度(mg/mL)，y為吸光值。在0～1.2 mg/mL內(nèi)葡萄糖含量與吸光值呈良好線性關(guān)系。測(cè)得北五味子中總多糖含量為153.2 mg/g。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取劑對(duì)北五味子多糖提取率的影響

取1 g北五味子干粉5份，分別按1∶20(g∶mL)加入50%乙醇、30%乙酸、石油醚、三氯甲烷、水，在超聲波功率為200 W，溫度為60℃條件下提取40 min，提取2次，合并提取液。提取液于4 000 r/min離心機(jī)中離心15 min，取1 mL上清液加入提取劑9 mL，混勻，再以提取劑為空白，按DNS法測(cè)540 nm處的吸光值。吸光值對(duì)應(yīng)葡萄糖含量乘以稀釋倍數(shù)，除以北五味子干粉的質(zhì)量，再除以總多糖，得到相對(duì)提取率。測(cè)得結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取劑對(duì)北五味子多糖提取的影響

由圖2可知，用乙醇和水為提取劑的提取率較高，其中乙醇的相對(duì)提取率78.3%，且由于乙醇沸點(diǎn)低，便于后續(xù)濃縮分離工藝，宜選乙醇作為提取劑。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)北五味子多糖提取率的影響

分別采用30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，按2.2.1方法提取，測(cè)相對(duì)提取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)北五味子多糖提取的影響

圖3結(jié)果顯示，30%～70%的乙醇對(duì)北五味子多糖的提取能力是先增大后減小。乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)的相對(duì)提取率達(dá)到82.2%，繼續(xù)增大濃度則提取效果反而下降，原因是乙醇濃度過(guò)高會(huì)使細(xì)胞膜發(fā)生變性，阻止后續(xù)乙醇分子進(jìn)入細(xì)胞;而且乙醇濃度過(guò)高，會(huì)影響多糖的溶解度，導(dǎo)致在離心過(guò)程中，多糖成分隨殘?jiān)环蛛x掉，從而影響提取效果。故乙醇溶液宜選60%。

2.2.3 料液比對(duì)北五味子多糖提取率的影響

固定超聲波功率為 200 W，分別以 1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g∶mL)的料液比加入濃度為 60%的乙醇，在60℃下提取40 min，所得結(jié)果見(jiàn)圖4。料液比與提取率成反比，當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，多糖相對(duì)提取率達(dá)到86.4%，再降低料液比提取率增加不顯著。而低料液比會(huì)造成乙醇浪費(fèi)和后續(xù)濃縮的困難。故料液比宜選適1∶25。

圖4 料液比對(duì)北五味子多糖提取的影響

2.2.4 提取溫度對(duì)北五味子多糖提取率的影響

固定超聲波功率為200 W，料液比為1∶25，溫度分別設(shè)為 40、50、60、70、80℃，提取 40 min，所得結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明適宜的溫度能夠得到較高的提取率，溫度過(guò)高會(huì)增加能耗并造成溶劑因蒸發(fā)而損失，使提取率下降。因此，提取溫度宜選60℃。

圖5 溫度對(duì)北五味子多糖提取的影響

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)北五味子多糖提取率的影響

固定超聲波功率為200 W，料液比為1∶25，溫度為60℃，提取時(shí)間分別設(shè)為 30、40、50、60、70 min 進(jìn)行提取，所得結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，提取時(shí)間越長(zhǎng)，則相對(duì)提取率越高，一般認(rèn)為，提取率在90%左右時(shí)，在經(jīng)濟(jì)上較為合適［9］。因此，提取時(shí)間選擇為40 min。

圖6 時(shí)間對(duì)北五味子多糖提取的影響

2.3 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了對(duì)北五味子多糖提取率影響顯著的3個(gè)因素，即提取劑濃度(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)。運(yùn)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，利用Minitab軟件設(shè)計(jì)一個(gè)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，所得結(jié)果如表1所示。

以北五味子多糖相對(duì)提取率為響應(yīng)值，用Minitab15.0軟件對(duì)表1所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，X2、以及交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響顯著，X、1對(duì)響應(yīng)值影響不顯著，得到X對(duì)響應(yīng)值Y的影響可用回歸方程為:北五味子多糖提取率Y=86.63－2.54 X2－3.03 X3－5.03－7.60－2.43 X1X2+6.35 X2X3，決定系數(shù)R2為97.68%。方差分析結(jié)果表明，模型在α=0.01水平上回歸顯著，失擬不顯著，因此模型選擇正確，可用該方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。求解得到最佳條件為:X1=－0.53，X2=0，X3=－0.2，換算得到各因素的實(shí)際水平分別為∶乙醇濃度X1=54.7%、料液比X2=1∶25=58℃，模型預(yù)測(cè)結(jié)果為86.93%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)五味子多糖相對(duì)提取率為87.12%(n=3)。根據(jù)回歸方程繪制的響應(yīng)面和等高線分析圖見(jiàn)圖7～圖9。響應(yīng)面可以直接反應(yīng)各因子對(duì)響應(yīng)值影響的大小，由等高線圖可得到最優(yōu)條件下各因子的取值［10］。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

圖7 Y=f(X1，X2)響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖

圖8 Y=f(X2，X3)響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖

圖9 Y=f(X1，X3)響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖

圖7顯示，乙醇濃度與料液比交互作用顯著而且復(fù)雜，在高料液比、高乙醇濃度的較小區(qū)域內(nèi)，可得到較高的提取率;固定提取溫度為60℃時(shí)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為68.2%時(shí)，料液比為1∶23.3時(shí)，相對(duì)提取率可達(dá)89.00%。圖8顯示，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，料液比與提取溫度的關(guān)系，當(dāng)提取溫度為57.1℃，料液比為1∶23時(shí)，提取率可達(dá)87.81%。圖9顯示，固定料液比為1∶25時(shí)，乙醇濃度與提取溫度的交互作用顯著，在相對(duì)較低溫度、高乙醇濃度的范圍內(nèi)，可獲得較高的提取率;當(dāng)提取溫度為57.6℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為68.9%時(shí)，預(yù)測(cè)提取率可達(dá)88.79%。

2.4 北五味子多糖對(duì)·OH、·清除率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

圖10 北五味子多糖對(duì)·OH、·清除能力

本文采用單因素結(jié)合響應(yīng)曲面法對(duì)超聲輔助乙醇提取條件進(jìn)行了研究，并考察了北五味子多糖的抗氧化性能。結(jié)果表明，乙醇濃度，溫度，料液比對(duì)北五味子多糖提取率有顯著影響，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了關(guān)鍵影響北五味子多糖提取率的二次多項(xiàng)式:北五味子多糖提取率Y=86.63－2.54 X2－3.03 X3－5.03－7.60－2.43X1X2+6.35 X2X3，得到最佳提取條件為:乙醇濃度X1=54.7%、料液比X2=1∶25、提取溫度X3=58℃;其他條件為:超聲功率200 W，提取時(shí)間40 min，提取次數(shù)2次，在此條件下，北五味子多糖相對(duì)提取率為87.12%(n=3)，優(yōu)于傳統(tǒng)的水提法和醇提法。北五味子多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性能，當(dāng)濃度為1.2 mg/mL時(shí)，·OH、清除率分別為66.7%、44.5%。

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