張帥，梁桂娟，吳世蘭，秦禮康

1(貴州大學(xué)，貴州貴陽(yáng)，550025)2(貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽(yáng)，550003)

丙烯酰胺(acrylamide，AA)是一種不飽和酰胺［1］，食品中的丙烯酰胺之所以受到關(guān)注是因?yàn)樗亩拘?俗稱丙毒)。2002年4月，由瑞典國(guó)家食品管理局和斯德哥爾摩大學(xué)聯(lián)合宣稱，在食品中含有對(duì)人體具有潛在致癌性的丙烯酰胺，尤其是以薯?xiàng)l為代表的富含碳水化合物的高溫油炸食品中含量最為豐富［2］。該問題引起了國(guó)際社會(huì)的高度重視，WHO/FAO把食品中的丙烯酰胺作為優(yōu)先評(píng)估對(duì)象［3］。此外，丙烯酰胺已被證明具有神經(jīng)毒性、基因毒性和生殖毒性［4－7］。

目前，對(duì)食品中丙烯酰胺的研究主要集中于高淀粉含量油炸食品、焙烤食品以及飲用水。有研究認(rèn)為，高淀粉含量油炸食品、焙烤食品為高溫、低濕的典型的Maillard反應(yīng)體系，其反應(yīng)產(chǎn)物一部分對(duì)食品色澤、風(fēng)味的形成具有重要作用，但同時(shí)也產(chǎn)生了醛類、雜環(huán)胺等有害的中間產(chǎn)物，隨后通過一系列復(fù)雜化學(xué)變化產(chǎn)生丙烯酰胺［1，8］。國(guó)內(nèi)外測(cè)定食品中AA的方法一般采用 GC-MS、HPLC、HPLC-MS或 HPLC-MS/MS［9－12］。美國(guó) FDA 發(fā)布了采用 HPLC-MS/MS，以13C3-丙烯酰胺為內(nèi)標(biāo)的同位素稀釋技術(shù)測(cè)定食品中丙烯酰胺的含量［13－14］。

豆豉、腐乳、豆醬以及醬油等豆類傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，現(xiàn)已發(fā)展成為我國(guó)最具優(yōu)勢(shì)和特色的新興產(chǎn)業(yè)。但是，產(chǎn)品發(fā)酵過程中易受原料品質(zhì)波動(dòng)、雜菌污染以及環(huán)境因素的影響，產(chǎn)品質(zhì)量極難穩(wěn)定，存在較大的安全隱患，如生物胺、病原微生物及其毒素等內(nèi)源性污染物，這些都已成為高蛋白豆類發(fā)酵調(diào)味品工業(yè)的安全隱患因子。為有效評(píng)價(jià)發(fā)酵豆制品中AA的含量狀況，研究發(fā)酵豆制品中產(chǎn)生AA的機(jī)理以及相應(yīng)的控制措施，目前迫切需要建立穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速簡(jiǎn)便的測(cè)定發(fā)酵豆制品中AA的方法。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品:純度＞99.8%，美國(guó)Sigma公司;13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，英國(guó)Cambridge Isotope Laboratories。甲醇、甲酸:色譜純;超純水;乙酸鋅［Zn(CH3COO)2］，亞鐵氰化鉀［K4Fe(CN)6］:分析純;PES 0.22 μm水相濾膜。腐乳、豆豉以及豆醬均購(gòu)自于貴陽(yáng)市花溪合力超市與佳宇超市。

1.2 儀器和設(shè)備

UPLC-TQD Waters高效液相四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司);6 mL 200 mg OASIS固相萃取柱(美國(guó) Waters公司);X-22R冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司);Multi Reax旋渦混合器(德國(guó)Heidolph公司);Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)(中國(guó)密理博公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.01 mg，置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，1～4℃低溫保存作為儲(chǔ)備溶液。分別配制0.01，0.05，0.1，0.2，1 μg/mL 的 AA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，13C3-丙烯酰胺為內(nèi)標(biāo)，濃度為1 μg/mL。

2.2 樣品處理

稱取樣品1.0 g于50 mL離心管內(nèi)，加500 μL 1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)液(13C3-AA)，加入20 mL石油醚，振蕩15 min，棄去石油醚，反復(fù)操作2次。加乙酸鋅與亞鐵氰化鉀各3 mL進(jìn)行蛋白質(zhì)的沉淀，加入超純水定容至20 mL，振蕩15 min，冷凍離心(4℃，3 600 r/min)15 min，過濾待用。HLB固相萃取柱(6 mL 200 mg OASIS)先用5 mL甲醇活化和5 mL超純水平衡，然后吸取待用液2 mL緩慢通過HLB固相萃取柱，1 mL超純水淋洗，最后用2 mL 40%甲醇水溶液(含有0.01%甲酸)洗脫，收集洗脫液。過0.22 μm水相濾膜，備用待測(cè)。

2.3 色譜條件

ACQUITY UPLC C18色譜柱(210 mm×20 mm，1.7 μm，美國(guó) Waters公司);柱溫:30℃;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相:超純水-甲醇(99∶1，其中分別加入0.1%甲酸)。

2.4 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)方式:MRM;離子源溫度:120℃;脫溶劑氣溫度:350℃;定性、定量離子對(duì)，碰撞能量以及錐孔電壓見表1。

表1 丙烯酰胺的質(zhì)譜參數(shù)

2.5 結(jié)果計(jì)算

試樣中AA含量的計(jì)算:

其中，X為樣品中丙烯酰胺的含量，mg/kg;A為質(zhì)譜儀測(cè)定的丙烯酰胺的含量，ng/mL;2為待用液過HLB固相萃取柱體積，mL;N為稀釋倍數(shù);R/%為回收率;m為樣品質(zhì)量，g。

計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

3 結(jié)果與討論

3.1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

將 0.01，0.05，0.1，0.2，1 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。曲線回歸方程(Y為響應(yīng)值，X為試樣質(zhì)量濃度)Y=81.827 6X+415.248，相關(guān)系數(shù) R=0.992 425，R2=0.984 907，該方法在0.01～1 μg/mL都有良好的線性。見圖1。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以13C3-丙烯酰胺為內(nèi)標(biāo)，濃度為1 μg/mL，使用固相萃取柱進(jìn)行萃取，其中洗脫液(甲醇水溶液)的濃度對(duì)回收率影響較大。實(shí)驗(yàn)選取3組樣品，分別在洗脫液濃度為20%，40%，60%，80%下對(duì)回收率進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度洗脫液對(duì)回收率的影響 %

3.3 液相色譜條件的優(yōu)化

選擇超純水與甲醇(0.1%甲酸)作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相配比在超純水與甲醇的體積比為99∶1的條件下峰形較其他參考條件下［15－17］峰形好，可以顯著改善拖尾現(xiàn)象。由于丙烯酰胺在質(zhì)譜儀中分解為正離子，因此，加入0.1%的甲酸，能顯著提高響應(yīng)強(qiáng)度。圖2為不同流動(dòng)相條件下的質(zhì)譜圖。圖a流動(dòng)相為超純水-甲醇(95∶5，分別添加0.1%甲酸);圖b流動(dòng)相為超純水-甲醇(99∶1，分別添加0.1%甲酸)。從圖2可以看出，加大流動(dòng)相中超純水的比例，可以顯著延長(zhǎng)丙烯酰胺的出峰時(shí)間，從而有效分離目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰。

3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于丙烯酰胺的相對(duì)分子質(zhì)量較低，因此所得碎片離子質(zhì)量也低。選擇MRM方式進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)靈敏度高，重現(xiàn)性好。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，母離子(m/z 72)通過脫氨能夠得到子離子(m/z 55)，具有較高的相對(duì)豐度，當(dāng)施加的碰撞能為12 eV時(shí)，達(dá)到最大值，當(dāng)使用定性子離子(m/z 44)需要更大的碰撞能量，因此，選擇m/z 55作為定量離子。丙烯酰胺的色譜圖見圖3。圖a表示13C3-丙烯酰胺的質(zhì)譜圖，m/z為74.79∶58;圖b表示丙烯酰胺定量時(shí)質(zhì)譜圖，m/z為72.2∶55;圖c表示丙烯酰胺定性是質(zhì)譜圖，m/z為72.2∶44;圖d表示總離子流圖。

圖2 不同流動(dòng)相條件下質(zhì)譜圖的比較

3.5 方法精密度與加標(biāo)回收率

以腐乳、豆豉、豆醬3種不同類型樣品，加入1 mL 內(nèi)標(biāo)液(13C3-AA)，濃度分別為 1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.1 μg/mL。測(cè)得該方法的回收率范圍，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。測(cè)定結(jié)果見表3、表4和表5。從表中可以看出，腐乳的回收率在84.0%～88.3%，平均回收率為86.6%。豆豉的回收率在90.1%～93.1%之間，平均回收率為91.7%。豆醬的回收率在83.9%～87.4%，平均回收率為85.0%。它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=5)均小于10%。因此，該方法可以用來分析測(cè)定腐乳、豆豉以及豆醬中丙烯酰胺的含量。

3.6 各樣品中丙烯酰胺的含量

使用該實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)不同地區(qū)不同品牌的豆豉、豆醬以及腐乳中的丙烯酰胺的含量進(jìn)行了分析檢測(cè)，結(jié)果見表6。

圖3 13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)物與丙烯酰胺標(biāo)品測(cè)定的HPLC-MS圖

表3 腐乳的回收率實(shí)驗(yàn)

表4 豆豉的回收率實(shí)驗(yàn)

表5 豆醬的回收率實(shí)驗(yàn)

表6 樣品中丙烯酰胺的含量

從表6中的數(shù)據(jù)可知，在選取的豆豉樣品中，丙烯酰胺的含量范圍在1～15 mg/kg之間，豆醬在0.4～2 mg/kg之間，腐乳在2～8 mg/kg之間。豆豉中丙烯酰胺的含量明顯高于腐乳與豆醬，而采用不同菌種進(jìn)行發(fā)酵的豆豉中丙烯酰胺的含量也差異明顯。

在表6中，編號(hào)1～6的樣品發(fā)酵采用的菌種為曲霉，7～9為毛霉，10～14為細(xì)菌?？梢钥闯觯拱l(fā)酵的豆豉丙烯酰胺含量普遍偏高，毛霉型次之，細(xì)菌型普遍較低。

發(fā)酵豆制品中產(chǎn)生丙烯酰胺的途徑可能有2種:

一是在生產(chǎn)加工過程原材料中還原糖和氨基發(fā)生的Maillard反應(yīng)。在豆豉生產(chǎn)過程中，其中一步驟為蒸煮與冷卻。此時(shí)的外界環(huán)境從高溫轉(zhuǎn)為低溫，濕度很高，而伴隨著原材料中本身含有的還原糖和氨基化合物，極有可能發(fā)生非典型Maillard反應(yīng)，為丙烯酰胺的產(chǎn)生提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，再通過隨后的一系列化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生丙烯酰胺。

二是由于其中微生物的生理生化過程中，在酶的作用下，產(chǎn)生了一系列丙烯酰胺的前體物質(zhì)，如丙二醛、丁二酮、丙酮醛等，再反應(yīng)形成丙烯酰胺。接種時(shí)曲霉型、毛霉型以及細(xì)菌型發(fā)酵豆豉的區(qū)別在于所接種的微生物類型不同。曲霉發(fā)酵的豆豉中曲霉類型主要有巢狀亞屬巢狀組埃及曲霉(Aspergillus egyptiacus Moub.＆Moust.)，煙色亞屬煙色組煙曲霉原變種(Aspergillus fumigatus)和環(huán)繞亞屬黃綠組寄生青霉群(Aspergillus oryzae)［18］。毛霉發(fā)酵的豆豉所接種的主要以總狀毛霉為主，但也有一定數(shù)量的枯草芽孢桿菌存在［19－20］。而細(xì)菌型豆豉則主要采用的是自然接種，參與的微生物主要有豆豉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌及微球菌［21］。在產(chǎn)生丙烯酰胺的第2種途徑來看，可能由于各種微生物酶系的差異，導(dǎo)致發(fā)酵過程中外界環(huán)境所影響的自身酶系活力的差異，最終影響了丙烯酰胺的含量。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了使用HPLC-MS測(cè)定中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺含量的方法。由于出峰時(shí)間短，樣品前處理簡(jiǎn)便，使用電噴霧四級(jí)桿質(zhì)譜儀MRM掃描方式靈敏度高，重現(xiàn)性好，能更好滿足發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺含量的測(cè)定。從丙烯酰胺測(cè)定的結(jié)果來看，由于飲用水是人體攝入丙烯酰胺的主要來源，許多國(guó)家規(guī)定飲用水中含量不能超過0.25 mg/kg，瑞典研究人員推定消費(fèi)者食品中丙烯酰胺的平均暴露量為40μg/(人·d)［22］。從表6的測(cè)定結(jié)果來看，中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中丙烯酰胺含量偏高，因此，其中丙烯酰胺產(chǎn)生的具體機(jī)理以及如何控制降低其含量還有待進(jìn)一步的研究分析。

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