秦偉帥，趙新節(jié)，張娜，翟衡

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安，271018)2(山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南，250353)

揮發(fā)性香氣化合物是葡萄酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，主要包括醇類、酯類、萜烯類、醛酮類和酚類等［1－2］。這些成分的種類、含量、感官閾值及其之間的相互作用影響著葡萄酒的風(fēng)味和典型性。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在酵母對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的影響研究方面做了大量工作。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，不同酵母發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒，酒中香氣成分差別微小，而含量差別明顯。Giacomo Mauriello等人對(duì)意大利葡萄酒產(chǎn)區(qū)的36種酵母發(fā)酵的葡萄酒進(jìn)行氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，不同菌株發(fā)酵的葡萄酒香氣成分含量差距較大［3］。潘秋紅等人研究了3種酵母對(duì)貴人香干白葡萄酒香氣的影響，結(jié)果表明，不同酵母菌株的產(chǎn)酸、產(chǎn)醇和產(chǎn)酯能力存在很大差異［4］。目前，研究酵母香氣物質(zhì)代謝通常有葡萄品種香氣的參與，而在模擬葡萄汁培養(yǎng)基中關(guān)于酵母自身香氣物質(zhì)合成的研究較少。在應(yīng)用GC－MS技術(shù)對(duì)葡萄酒香氣進(jìn)行分析時(shí)，Pawliszyn等人于1990年研發(fā)出了固相微萃取技術(shù)(簡(jiǎn)稱SPME)［5］。該技術(shù)高效、簡(jiǎn)單、快速且成本低。目前，已經(jīng)在果實(shí)及酒類分析檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用［6－7］。

本研究以4株商業(yè)葡萄酒酵母為試驗(yàn)材料，采用HS－SPME－GC－MS方法分析酵母代謝的香氣物質(zhì)，通過(guò)模擬葡萄汁發(fā)酵法研究確定釀酒酵母自身香氣物質(zhì)合成的差異性，為葡萄酒釀造中酵母菌株的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

商業(yè)釀酒酵母菌株:CY3079、D254、EC1118和RC212，均于2011年購(gòu)自上海杰兔工貿(mào)有限公司。

1.2 試劑

香氣標(biāo)準(zhǔn)品:乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、2-苯乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸、己酸、辛酸和癸酸，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;內(nèi)標(biāo)物4-甲基-2-戊醇(色譜醇98%)購(gòu)自美國(guó)Aldrich公司;NaCl(分析純)。

1.3 儀器與設(shè)備

手動(dòng) SPME進(jìn)樣器、萃取頭 50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美國(guó) Supelco公司;GC-2010/QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司;Stabilwax-DA毛細(xì)管柱(30 m ×0.32 mm×0.25 μm)，美國(guó)J＆W公司。

1.4 方法

1.4.1 酵母生長(zhǎng)條件

將酵母分別接種到3 mL YPD培養(yǎng)基上(1%酵母浸粉、2%蛋白胨和2%葡萄糖)，28℃培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接到50 mL改良的MS300培養(yǎng)基(葡萄糖和果糖濃度分別為60 g/L)，上25℃搖瓶好氧培養(yǎng)24 h。然后接種到100 mL三角瓶中厭氧發(fā)酵(含有80 mL MS300培養(yǎng)基)。MS300培養(yǎng)基成分包括:120 g/L葡萄糖、120 g/L果糖、6 g/L檸檬酸、6 g/L DL-蘋果酸、300 mg/L的酵母可同化氮源(銨和氨基酸)、鹽、維生素和厭氧因子(15 mg/L麥角固醇、5mg/L油酸鈉和0.5 mL/L吐溫 80溶解于5 mL乙醇中)［8］。MS300培養(yǎng)基模擬了標(biāo)準(zhǔn)葡萄汁，但是不包括葡萄的品種香氣和沒(méi)有氣味的前體物質(zhì)。酵母接種量為106個(gè)/mL(在接種之前用0.9%的NaCl清洗除去表面營(yíng)養(yǎng)成分)。發(fā)酵溫度控制在20℃;pH 3.5。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 香氣物質(zhì)提取

精確量取8 mL酒樣放入15 mL的頂空瓶中，加入1 g NaCl，促進(jìn)香氣成分的揮發(fā)，再加入30 μL內(nèi)標(biāo)(4-甲基-2-戊醇)，立刻用PTFE/硅橡膠隔墊密封壓緊。當(dāng)溫度到達(dá)45℃時(shí)，用DVB/CAR/PDMS的萃取頭萃取50 min，進(jìn)樣進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4.3 GC/MS條件

程序升溫為30℃保持1 min，以6℃/min升至100℃，以3℃/min升溫至200℃，以10℃/min升溫至210℃，保持3 min。進(jìn)樣器溫度250℃;檢測(cè)器溫度250℃;無(wú)分流進(jìn)樣。

電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度200℃;全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍:30～400 u。

1.4.4 香氣成分的定性與定量分析

定性分析:用氣相色譜-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定。分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST08和WILEY7)進(jìn)行初步檢索及資料分析，再結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確認(rèn)香氣物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)成分。

定量分析:采用內(nèi)加標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行定量。

1.4.5 酒樣的感官分析

不同酵母發(fā)酵的酒樣放在通風(fēng)良好、無(wú)任何氣味的房間內(nèi)，分別由專業(yè)人員采用定量描述分析法(QDA)進(jìn)行酒樣感官的定性和定量評(píng)價(jià)［9］。

實(shí)驗(yàn)采用線性標(biāo)度為評(píng)分標(biāo)尺，即在1條10 cm線段上面標(biāo)記出能代表某感官性質(zhì)強(qiáng)度或數(shù)量的位置，線段最左端代表“沒(méi)有”或者“0”，最右端代表“最大”或者“最強(qiáng)”。用直尺把每種強(qiáng)度轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的數(shù)值，然后輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。

感官評(píng)定人員各自對(duì)樣品進(jìn)行品評(píng)，然后獨(dú)立記錄能反映酒樣感官特征的不同參數(shù)(即描述詞匯)。由實(shí)驗(yàn)小組組長(zhǎng)匯總并分類全部詞匯，與小組全體人員共同討論，確定最終的描述詞匯(花香、果香、甜味、酵母味、刺激味、脂肪味、酸味)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵參數(shù)

商業(yè)酵母菌株 RC212、D254、EC1118和 CY3079分別在20℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后乙醇體積分?jǐn)?shù)、殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸和pH值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。各酒樣pH均為3.4。酵母D254具有較高的揮發(fā)酸水平(0.58 g/L)，而酵母 EC1118揮發(fā)酸含量最低，為0.46 g/L。各酒樣殘?zhí)蔷陀? g/L，其中D254具有較低的殘?zhí)呛?3.54 g/L)。RC212和EC1118酒樣具有較高的總酸含量，分別為9.13和9.11 g/L。各酵母發(fā)酵酒樣乙醇體積分?jǐn)?shù)相差不大，RC212和D254乙醇體積分?jǐn)?shù)為13.9%，比EC1118和CY3079酒樣高0.1度。

表1 不同商業(yè)酵母菌株20℃條件下的發(fā)酵參數(shù)

2.2 酵母香氣物質(zhì)GC-MS分析

對(duì)表2中酵母發(fā)酵的酒樣進(jìn)行香氣物質(zhì)的定性定量分析發(fā)現(xiàn)，4種酵母自身合成的香氣物質(zhì)種類沒(méi)有差別，共有19種，主要包括9種酯、4種高級(jí)醇和6種酸。酵母D254合成的香氣物質(zhì)總量為1 174.72 mg/L，在4株酵母中香氣物質(zhì)合成量最高;酵母CY3079和EC1118合成的香氣物質(zhì)總量相差不大，分別為1 066.16 mg/L和1 014.32 mg/L;酵母RC212合成的香氣物質(zhì)總量為987.96 mg/L，低于其他3株酵母。

高級(jí)醇是酵母代謝的主要香氣物質(zhì)，這類物質(zhì)主要通過(guò)酵母的氨基酸合成和分解代謝途徑生成［10］。研究表明，正丙醇(酒精味)、異丁醇(酒精味)、異戊醇(苦味、雜醇味、刺激味)和2-苯乙醇(花香或玫瑰花香)是酵母合成的主要高級(jí)醇。在這4種醇中，異戊醇是主要的高級(jí)醇，約占高級(jí)醇總量的50%左右。CY3079菌株高級(jí)醇生成量最高(501.66 mg/L)，其中異戊醇生成量為259.12 mg/L;D254和RC212次之，異戊醇生成量分別為238.20和223.33 mg/L;EC1118菌株高級(jí)醇的生成量最低(453.47 mg/L)，異戊醇生成量為238.70 mg/L。異丁醇檢測(cè)結(jié)果表明，D254生成量最高(164.55 mg/L)，EC1118生成量最低(119.06 mg/L)。RC212具有較高的正丙醇生成能力(42.25 mg/L)。2-苯乙醇的生成量在各菌株中差別不大，均在60 mg/L左右。

由表2可以看出，酸類物質(zhì)在總香氣物質(zhì)中含量最高，乙酸為主要組分。D254酵母具有較高的產(chǎn)酸能力，乙酸生成量為628.66 mg/L;菌株 CY3079和EC1118產(chǎn)酸能力差別不大，其中乙酸生成量分別為507.28 mg/L和502.00 mg/L;菌株RC212具有較低的產(chǎn)酸能力，乙酸生成量為471.26 mg/L。不同酵母菌株中鏈脂肪酸生成量不同。雖然C6－C10脂肪酸通常與不好的氣味相關(guān)，但是它們對(duì)葡萄酒的香氣平衡性非常重要［11］。菌株 EC1118具有較高的辛酸(1.81 mg/L)、己酸(1.78 mg/L)和癸酸(1.07 mg/L)的合成能力，而菌株D254的異戊酸(0.94 mg/L)和異丁酸(2.16 mg/L)合成能力較強(qiáng)。這類酸的出現(xiàn)主要與酒的果香、奶酪、脂肪和酸味有關(guān)［12］。

表2 不同酵母菌株酒樣的香氣物質(zhì)濃度(mg/L，n=3)

本研究中4株酵母均表現(xiàn)出了較高的酯類物質(zhì)的生成能力。由表2可以看出，酵母合成的酯類物質(zhì)主要包括9種。其中乙酸乙酯(愉悅的、甜的水果香)是酵母合成的主要酯類。菌株D254乙酸乙酯的生成量最高(54.16 mg/L)，RC212最低(40.93 mg/L)。其他酯類主要包括:乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和月桂酸乙酯。這些酯對(duì)葡萄酒香氣中的花香和果香貢獻(xiàn)非常大［1］。菌株D254總酯的生成量最大(56.79 mg/L)，比菌株 RC212(42.66 mg/L)高 14.13 mg/L。EC1118總酯生成量居中，但是具有較高的乙酸-2苯乙酯(玫瑰花香)生成能力(0.54 mg/L)。

2.3 酒樣的感官分析

品評(píng)員分別對(duì)各酒樣從7個(gè)感官特性進(jìn)行了定量描述分析。其中的描述性詞匯是評(píng)價(jià)小組按照已定義的感官特性來(lái)識(shí)別酒樣給人的感覺(jué)。從圖1可以看出，各酵母在相同的感官特性上所表達(dá)的每種特性的強(qiáng)度不同。菌株EC1118發(fā)酵的酒樣花香和甜味比較明顯，具有較低的刺激性。CY3079菌株刺激性比較大，RC212次之，這可能與高級(jí)醇含量高低有關(guān)。菌株D254具有較突出的果香，酸味也高于其他菌株，這可能與酒樣中含有較高濃度的酯類和乙酸有關(guān)。各菌株之間脂肪味和酵母味差別不大。

圖1 各酵母菌株的QDA數(shù)據(jù)蜘蛛網(wǎng)形圖

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)4株商業(yè)酵母CY3079、D254、EC1118和RC212香氣成分的定性定量分析表明，酵母自身合成的香氣物質(zhì)有19種，主要包括9種酯、4種高級(jí)醇和6種酸。有不同酵母菌株香氣物質(zhì)合成存在很大差別。CY3079具有較高的高級(jí)醇生成能力，其中異戊醇和2-苯乙醇的合成均高于其他酵母菌株。D254酵母具有較高的酯類和揮發(fā)酸類合成能力，其中乙酸乙酯和乙酸對(duì)酵母D254總酯和總揮發(fā)酸的含量貢獻(xiàn)較大。EC1118高級(jí)醇生成量最低，但是具有較高的乙酸-2-苯乙酯生成能力。RC212具有較低的酯類和揮發(fā)酸的生產(chǎn)能力，高級(jí)醇的生成量居中。

感官品評(píng)試驗(yàn)表明，菌株D254的果香和酸味比較明顯。CY3079酒樣的刺激性比較大。EC1118具有比較突出的花香。RC212香氣濃郁度適中，沒(méi)有明顯的刺激味。

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