于海，王敏，李夢璐，葛慶豐，吳滿剛，汪志君

(揚州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚州，225127)

谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)存在于很多細(xì)菌和真核微生物中［1］，是谷氨酰胺分解的關(guān)鍵酶和限速酶［2-3］。含氮有機物如蛋白質(zhì)等經(jīng)過蛋白酶及肽酶的催化降解作用形成一些小分子的含氮化合物如谷氨酰胺等［4］，而谷氨酰胺酶則可繼續(xù)催化水解谷氨酰胺等生成谷氨酸和NH4+［5］，在谷氨酸形成過程中起著重要作用［4］，而谷氨酸與火腿等發(fā)酵肉制品的鮮味形成有關(guān)［6-8］。

火腿是我國歷史悠久的肉制品之一，深受消費者喜愛?；鹜鹊某墒爝^程主要由內(nèi)源酶、微生物外源酶以及其他非酶促理化反應(yīng)而共同形成［9］，其中微生物外源酶中谷氨酰胺酶在肉制品中具有明顯的增鮮作用。M-Asunción Durá等人將產(chǎn)谷氨酰胺酶菌株作為發(fā)酵劑或谷氨酰胺酶加入到香腸中，可明顯地改善香腸的感官和品質(zhì)［10］。此外，谷氨酰胺酶催化形成的氨還可以減少發(fā)酵肉制品中乳酸等酸類物質(zhì)的含量，降低產(chǎn)品的酸度，改善口感［11-12］。

腐生葡萄球菌作為發(fā)酵劑已經(jīng)應(yīng)用于發(fā)酵里脊肉、發(fā)酵鴨肉香腸等發(fā)酵肉制品的加工工藝中，而且研究人員對腐生葡萄球菌對發(fā)酵肉制品脂質(zhì)分解氧化規(guī)律以及脂質(zhì)氧化產(chǎn)物對風(fēng)味特性的影響也進行研究［13-14］。但與發(fā)酵肉制品鮮味形成有關(guān)的谷氨酰胺酶催化條件的研究還不夠深入，因此本文利用從如皋火腿中分離得到的1株腐生葡萄球菌RG-2，通過單因素試驗及響應(yīng)面設(shè)計方法分析其谷氨酰胺酶的特性，從而為利用腐生葡萄球菌開發(fā)肉品發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)RG-2，由實驗室篩選保藏。

L-谷氨酰胺，購自上海生工生物有限公司;L-谷氨酸，購自上海藍(lán)季科技公司;其它試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和MSA培養(yǎng)基的配制方法參照文獻［15］進行。

1.2.2 粗酶液的制備

將腐生葡萄球菌RG-2接種至MSA液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h后，以1%接種量接至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)60 h，調(diào)菌密度至 1010CFU/mL，之后取此菌液 2 mL，4℃、8 000×g離心15 min，沉淀用pH 6.0的TE緩沖液(50 mmol Tris-HCl、5 mmol EDTA)洗滌 2 次，棄去上清液后再次加入2 mL pH 6.0的TE緩沖液后，在37℃保溫條件下用溶菌酶處理3 h后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎，破碎條件:400 W，超聲5 s間隔5 s，120次。細(xì)胞破碎液4℃、8 000×g離心10 min，取上清液備用。

1.2.3 谷氨酰胺酶的測定

采用納氏試劑法繪制銨標(biāo)液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mL粗酶液，加入pH6.0的1%谷氨酰胺溶液8 mL，再加入pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液2 mL，37℃保溫1 h，納氏試劑法測氨濃度。

酶活力定義:在37℃，pH 6.0條件下每小時催化谷氨酰胺產(chǎn)生1 μmol NH3定義為1個酶活力單位。

1.3 谷氨酰胺酶催化條件的單因素試驗

固定催化溫度、pH、NaCl濃度3因素中的2個因素，按照表1設(shè)計改變其中一個因素，以谷氨酰胺酶酶活為響應(yīng)值，進行單因素試驗。

表1 單因素試驗設(shè)計表

1.4 谷氨酰胺酶催化條件的響應(yīng)曲面設(shè)計

1.4.1 Box-Behnken 試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以不同條件下的谷氨酰胺酶酶活為響應(yīng)值，選取溫度、pH、NaCl濃度為影響因素，進行3因素3水平分析，共17個試驗點，其中5個為中心點。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)曲面實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件對響應(yīng)值進行多元回歸分析，建立回歸方程。對回歸模型結(jié)合三維響應(yīng)面圖和等高線圖，判斷是否存在穩(wěn)定點，據(jù)此得出最大酶活的主效因子條件，建立優(yōu)化的催化條件并建立模型進行驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株粗酶酶活的測定

采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)60h后，菌株RG-2的粗酶液酶活約為13.7 U/mL。谷氨酰胺酶的催化產(chǎn)物谷氨酸是肉制品鮮味的主要組成物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)，較高的谷氨酰胺酶酶活表明該菌株能產(chǎn)生足量的谷氨酸以保證肉制品較好的鮮味。

2.2 谷氨酰胺酶催化條件的單因素試驗

2.2.1 pH對谷氨酰胺酶酶活的影響

催化體系為37℃，不添加NaCl，改變反應(yīng)體系pH進行單因素試驗，酶活結(jié)果如圖1所示，在pH 4.2～4.8范圍內(nèi)，腐生葡萄球菌RG-2所產(chǎn)谷氨酰胺酶活力隨pH值增大略有上升，但酶活較低;在pH 5.4～6.6范圍內(nèi)酶活隨pH增大快速上升，并在pH 6.6 時達(dá)到最大值，為 18 U/mL，在 pH 6.6～7.8 范圍內(nèi)酶活隨pH增大快速下降。

圖1 pH值對菌株RG-2谷氨酰胺酶酶活的影響

據(jù)文獻報道，源于微生物的谷氨酰胺酶最適pH大約為 7～8［6，11］，而 Durá 分離的 1 株德巴利漢遜氏酵母所產(chǎn)谷氨酰胺酶最適pH約為8.5［11］。本文所用的菌株RG-2所產(chǎn)谷氨酰胺酶的最適pH約為6.6，低于文獻已報道的微生物源谷氨酰胺酶的最適pH，這可能與菌種所產(chǎn)酶特性有關(guān)，如韓銘海等［16］通過篩選得到的1株高產(chǎn)谷氨酰胺酶的菌株，為檸檬酸細(xì)菌屬，其最適pH為6.2。

2.2.2 溫度對谷氨酰胺酶酶活的影響

催化體系 pH值為6.0，不添加 NaCl，改變反應(yīng)體系反應(yīng)溫度并進行單因素試驗，酶活結(jié)果如圖2所示，腐生葡萄球菌RG-2谷氨酰胺酶活在32～37℃范圍內(nèi)隨溫度升高快速增加，當(dāng)溫度達(dá)到42℃時達(dá)到最大值，并且在42～47℃范圍內(nèi)均具有較高的催化活力。52～57℃時，酶因高溫而失活，酶活下降，該腐生葡萄球菌RG-2谷氨酰胺酶的最適溫度為42～47℃，42℃時酶活達(dá)到22 U/mL。

圖2 溫度對菌株RG-2谷氨酰胺酶酶活的影響

溫度對谷氨酰胺酶酶活性的影響較大。多數(shù)已報道的谷氨酰胺酶在37～45℃的溫度范圍最活躍［11，16-17］，而 Alexandra 等篩選得的1 株 Lactobacillus rhamnosus所產(chǎn)的谷氨酰胺酶的最適溫度在50℃［4］。本研究的菌株所產(chǎn)谷氨酰胺酶最適溫度可能為42～47℃，最高催化溫度范圍相對較大，屬于中溫酶范疇。

2.2.3 NaCl濃度對谷氨酰胺酶酶活的影響

根據(jù)以上單因素試驗，催化體系pH 6.6，反應(yīng)溫度42℃，改變反應(yīng)體系NaCl濃度進行單因素試驗，酶活結(jié)果如圖3所示:當(dāng)NaCl濃度低于2.0%時，NaCl對谷氨酰胺酶酶活無明顯影響，當(dāng)鹽濃度2.0%～3.0%時，NaCl對谷氨酰胺酶催化活力具有促進作用，當(dāng)鹽濃度超過3.0%，NaCl表現(xiàn)出對谷氨酰胺酶活力有抑制作用。由此可知，在該單因素試驗中，當(dāng)鹽濃度達(dá)到3.0%時，谷氨酰胺酶酶活達(dá)到最大值33 U/mL。

圖3 NaCl濃度對菌株RG-2谷氨酰胺酶酶活的影響

NaCl濃度對于谷氨酰胺酶的影響依菌種不同差異較大。Jeong-Min Jeon等［17］篩選得到的菌株L.reuteri KCTC3594所產(chǎn)的谷氨酰胺酶最適NaCl濃度為5%，而Alexandra等篩選得的1株Lactobacillus rhamnosus所產(chǎn)的谷氨酰胺酶的最適最適NaCl濃度只有2.5%［4］。因為火腿等發(fā)酵肉制品具有一定的鹽含量，所以研究NaCl濃度對于谷氨酰胺酶催化活力的影響具有重要的意義。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計

運用Design expert8.0中的Box-Behnken進行試驗設(shè)計如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計

2.3.1 Box-Behnken 試驗結(jié)果

響應(yīng)曲面法的試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。Design expert8.0軟件分析谷氨酰胺酶酶活回歸模型的顯著性，方差分析見表4。由表4可知:模型的 F值為731.29，P ＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著。失擬項的 P=0.085 0＞0.05，說明失擬項不顯著，該模型有較好的擬合度。根據(jù)回歸系數(shù)，可得二次多項回歸方程:

Y=40.26+3.03A+2.76B+0.59C+3.50AB+1.55AC+0.68BC-10.74A2-16.77B2-4.12C2，其中 R2=0.998 9。

表3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化催化條件與響應(yīng)值

表4 方差分析表

2.3.2 響應(yīng)曲面分析與條件優(yōu)化

各因素間交互作用的響應(yīng)曲面如圖4所示。

圖4 各因素交互影響谷氨酰胺酶酶活的響應(yīng)曲面和等高線圖

由圖4可知，AB、AC、BC交互作用均很顯著，失擬項不顯著(P＞0.05)。由圖4a可知，pH(A)與溫度(B)交互作用極顯著(P＜0.01)且F值較大，因素作用效果明顯;由圖4b可知，pH(A)與NaCl濃度(C)交互作用極顯著(P=0.000 9＜0.01)且 F值較大，因素作用效果明顯，但相對A-B較低;由圖4c可知，溫度(B)與NaCl濃度(C)交互作用顯著(0.01＜P＜0.05)，因素作用效果相對較差，但仍處于合理范圍之內(nèi);綜合以上結(jié)論并由曲面的彎曲程度和等高線可以看出，響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個具體的試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。模型優(yōu)化的最佳催化條件為:pH 6.702、溫度42.5℃、NaCl濃度為3.055%。采用優(yōu)化的條件對催化條件進行模型驗證，為操作方便，驗證實驗條件設(shè)為 pH 6.7、溫度43℃、NaCl濃度為3.1%。結(jié)果表明，此條件下測得的谷氨酰胺酶酶活為40.2 U/mL，與模型估計值40.683 4 U/mL相比，相對誤差為1.19%，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的催化條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，利用本試驗建立的模型在實踐中進行預(yù)測是可行的。

3 結(jié)語

RG-2菌株所產(chǎn)谷氨酰胺酶的最佳催化體系為:pH6.7、溫度 43 ℃、NaCl濃度為 3.1%。此時，谷氨酰胺酶的催化效率最高，達(dá)到40.2 U/mL，為預(yù)測值的98.8%。模型驗證實驗表明此模型具有較好的預(yù)測能力。谷氨酰胺酶在醬油釀造工業(yè)中早有應(yīng)用，并且研究較為深入，但對谷氨酰胺酶在肉制品中的應(yīng)用及研究還較少。鮮味是發(fā)酵肉制品不可或缺的優(yōu)良品質(zhì)之一，對滋味貢獻極大。研究成果對于該菌株及其所產(chǎn)谷氨酰胺酶在如皋火腿及其它發(fā)酵肉制品中的應(yīng)用具有重要的理論指導(dǎo)價值，為最佳發(fā)酵條件的確立提供參考依據(jù)。

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