鄧 龍 鄧 勛 尹大川 宋瑞清*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究院，哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040)

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)是我國(guó)北方主要造林樹種，在生態(tài)建設(shè)、環(huán)境修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。樟子松枯梢病是由松球殼菌(Sphaeropsissapinea(Fr．)Dyko et Sutton)引起的一種發(fā)生普遍、危害性大的世界性傳染性病害。松枯梢病屬于寄主主導(dǎo)性病害，對(duì)該病害的控制應(yīng)以提高寄主抗性及降低病原菌種群數(shù)量為主要方向[1]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界中資源豐富的拮抗微生物，具有抗菌譜廣、適應(yīng)性強(qiáng)和多機(jī)制性的特點(diǎn)[2]。首先，木霉菌競(jìng)爭(zhēng)作用強(qiáng)，它能迅速生長(zhǎng)，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)；它能產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌類物質(zhì)，如木霉素、膠霉素、綠色木霉素和抗菌肽等, 對(duì)多種病原菌有抑制作用；此外還具有重寄生作用, 通過(guò)胞外酶破壞病原菌細(xì)胞壁，削弱病原菌的生長(zhǎng)勢(shì), 甚至殺死病原菌。目前世界范圍內(nèi)已有以木霉菌為主要成分的生物殺菌劑，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用[3]。同時(shí)，木霉菌對(duì)植物還具有促生抗逆的作用，通過(guò)定殖和次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長(zhǎng)[4]，提高其抗病能力。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，利用篩選獲得的高效木霉菌株T-43對(duì)樟子松枯梢病菌進(jìn)行室內(nèi)抑菌研究，制備不同劑型菌劑進(jìn)行野外應(yīng)用研究，為進(jìn)一步研究木霉菌對(duì)樟子松枯梢病菌的抑菌機(jī)理并開發(fā)穩(wěn)定的生物菌劑打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

(1)木霉菌株：菌株T-43為自以色列引進(jìn)的菌株，保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物研究中心。

(2)病原菌株：樟子松枯梢病菌-松球殼菌(Sphaeropsissapinea)，分離自遼寧省防風(fēng)固沙研究所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的樟子松人工林，保藏于東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林微生物研究中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株T-43對(duì)樟子松枯梢病菌生長(zhǎng)的影響

(1)菌株T-43對(duì)病原菌的拮抗效果

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[5]。用0.5cm孔徑無(wú)菌打孔器分別切取PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d的木霉菌株和病原菌株菌餅，接種于PDA平板培養(yǎng)基上，間隔5cm。以單獨(dú)接種病原菌株和木霉菌株的平板培養(yǎng)作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每8h測(cè)量一次菌落半徑。計(jì)算被抑制率、菌絲生長(zhǎng)速度和相對(duì)抑制效果，對(duì)拮抗線進(jìn)行觀察和描述，統(tǒng)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)。

對(duì)峙培養(yǎng)中競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 菌株對(duì)峙培養(yǎng)中競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

被抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-對(duì)峙培養(yǎng)菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%

相對(duì)抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率

(2)菌株T-43非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制效果

非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的制備：將菌株T-43接種到PDA平板培養(yǎng)基上活化3d，用0.5cm無(wú)菌打孔器切取菌餅3片，接種于300 mL PDA培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)(25℃，150r/min)7d后，用8層紗布過(guò)濾。取濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/10，備用。

抑菌活性測(cè)定：采用生長(zhǎng)速率法。將上述非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物添加到PDA培養(yǎng)基中(終濃度20%)，搖勻，倒平板，待冷卻凝固后，接入病原菌。以不添加代謝產(chǎn)物的PDA平板培養(yǎng)作為對(duì)照。置于25℃恒溫培養(yǎng)5d后，采用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑，計(jì)算木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率，每處理3次重復(fù)。

1.2.2 菌株T-43防治樟子松枯梢病的野外應(yīng)用研究

試驗(yàn)地點(diǎn)：遼寧省固沙所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的樟子松人工林內(nèi)。

野外施用時(shí)間：2010年7月10日、7月20日和7月30日，防治三次。

試驗(yàn)菌劑：采用孢子粉劑和液體菌劑兩種。T-43孢子粉劑濃度為1.7×107個(gè)孢子/g，液體菌劑為發(fā)酵液原液。

施用方法：施用菌劑前調(diào)查所選樹木的病情指數(shù)。采用樹冠噴霧的方式施藥。每個(gè)濃度梯度防治20株樹，設(shè)3個(gè)重復(fù)，設(shè)定空白對(duì)照。

2010年9月調(diào)查病情指數(shù)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

病害損失估計(jì)采用分級(jí)計(jì)數(shù)法，以病情指數(shù)表示發(fā)病程度，病情指數(shù)計(jì)算：

病情指數(shù)=[∑(病級(jí)株數(shù)×代表數(shù)值)/株數(shù)總和×最重一級(jí)代表數(shù)值]×100

防治效果=(對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-防治區(qū)病情指數(shù))/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株T-43對(duì)樟子松枯梢病菌生長(zhǎng)的影響

對(duì)峙培養(yǎng)48h后，菌株T-43對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制率為60.17%(表2、圖1)，木霉菌株生長(zhǎng)速度快，競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)高，在同病原菌對(duì)峙培養(yǎng)中，迅速占領(lǐng)生態(tài)位。而病原菌在木霉抑制下幾乎停止生長(zhǎng)，并最終被木霉菌覆蓋。菌株T-43與病原菌拮抗培養(yǎng)形成明顯的拮抗線。菌株T-43對(duì)病原菌的相對(duì)抑制效果達(dá)到6以上。菌株T-43次生代謝產(chǎn)物中含有高效抑菌活性成分(圖1)，其原液對(duì)病原菌的抑菌率為92.94%。

表2 菌株T-43與病原菌對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果

2.2 菌株T-43的野外應(yīng)用研究

木霉菌劑對(duì)樟子松枯梢病具有顯著的控制效果，不同濃度梯度菌劑的防治效果存在顯著差異(表3)。液體菌劑(木霉次生代謝產(chǎn)物)防治效果高于孢子粉劑。液體菌劑10倍液對(duì)樟子松枯梢病的控制效果超過(guò)94%，隨著稀釋倍數(shù)的增大，防治效果逐漸降低，100倍液防治效果只有61.33%。孢子粉劑中，300倍液對(duì)病害的控制效果最好，也只有68%。

表3木霉菌株T-43菌劑防治樟子松枯梢病2010年統(tǒng)計(jì)結(jié)果

劑型濃度防治前/后各等級(jí)株數(shù)ⅠⅡⅢⅣ防治前/后病情指數(shù)防治效果孢子300X020/10/6033.33/43.3368.42粉劑500X040/10033.33/5052.64700X020/10/15033.33/58.3321.061000X000/15033.33/58.3321.062000X020/50/18033.33/63.335.27液體10X020/50/1033.33/3594.73菌劑20X020/20/3033.33/38.3384.2140X020/10/6033.33/43.3368.42100X090/7033.33/4561.33對(duì)照020/10/19033.33/65720/1420/1320/1

3 結(jié)論

通過(guò)木霉菌株T-43對(duì)樟子松枯梢病菌的室內(nèi)外生物測(cè)定結(jié)果，得出以下結(jié)論：菌株T-43非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中含有高效抑菌活性成分，對(duì)樟子松枯梢病具有明顯的控制效果。

參考文獻(xiàn)：

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