劉正華, 樂學義, 陳 實, 周曉華, 范 玲

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學 理學院 生物材料研究所,廣東 廣州 510642; 2. 中山市小欖農(nóng)產(chǎn)品質量檢驗檢測中心,廣東 中山 528415)

在食品生產(chǎn)經(jīng)營中違法添加有毒有害防腐劑已成為影響食品安全的突出問題之一,因此開發(fā)高效、無毒、環(huán)境友好型食品防腐劑勢在必行。殼聚糖(CTS)具有無毒、生物相容性好、可降解和抗菌活性等特點，是開發(fā)天然防腐抗菌劑的理想材料[1～8]。但CTS本身的水溶性和抗菌效果比較弱，達不到食品生產(chǎn)經(jīng)營中防腐保鮮的要求,通過化學改性方法提高其水溶性和抗菌活性是解決這一問題的關鍵。

Scheme1

本文擬通過化學改性的方法將水楊醛引入CTS中，并與人體必需的微量金屬元素Cu(Ⅱ), Mn(Ⅱ)配位，大大提高其溶解性和抗菌活性，為CTS類防腐劑的分子設計和應用進行了有益的探索，為制備高效無毒、綠色的天然殼聚糖基食品防腐劑提供了一種新的思路。

CTS的氨基與水楊醛發(fā)生反應制得殼聚糖希夫堿配體(L); L與銅鹽、錳鹽發(fā)生配位反應制得殼聚糖希夫堿Cu(Ⅱ)， Mn(Ⅱ)配合物(1和2, Scheme 1)，其結構經(jīng)UV, IR和熒光光譜表征。L的酚亞胺的N原子和酚羥基的O原子同時參與配位。初步抑菌活性測試結果表明，1和2對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌和枯草桿菌的抗菌活性較L和金屬鹽均有明顯提高。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Shimadzu UV-2550型紫外光譜儀;AVATAR 360 FT-IR型紅外光譜儀(KBr壓片);Nicolet RF-5301PC型熒光光譜儀;DTG-60型差熱熱重儀。

CTS, DD 88.1%,含量98.9%,山東奧康生物科技有限公司;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草桿菌，廣州微生物研究所;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) L的合成

在反應瓶中依次加入1%冰乙酸40 mL和CTS 1.00 g，攪拌使其完全溶解(透明溶液)，減壓過濾;攪拌下依次向濾液中緩慢加入無水乙醇50 mL和水楊醛2 mL，回流(75 ℃)反應8 h(淡黃色黏稠沉淀)。冷卻至室溫，減壓過濾，濾餅用95%乙醇反復洗滌至洗出液中無水楊醛(UV檢測λ=325 nm)。于-30 ℃真空冷凍干燥24 h得淡黃色粉末L。

(2) 1和2的合成

在反應瓶中依次加入水楊醛4 mL的無水乙醇(60 mL)溶液和CuCl2·2H2O 1.9 g,攪拌使其完全溶解，減壓過濾制得溶液A。

在反應瓶中依次加入蒸餾水50 mL和CTS 2.00 g，攪拌使其完全溶解，減壓過濾，攪拌下依次向濾液中緩慢加入無水乙醇30 mL和溶液A，攪拌3 min～5 min,回流(75 ℃)反應8 h。冷卻至室溫，用5%NaOH溶液調至pH 4(析出大量淡綠色沉淀)，減壓過濾，濾餅用蒸餾水洗滌3次～4次，再用無水乙醇反復洗滌至洗出液中無水楊醛，同時用0.1 mol·L-1Na2S溶液檢測洗出液中無黑褐色沉淀為止。于-30 ℃真空冷凍干燥24 h得淡綠色粉末1。

以MnCl2·4H2O代替CuCl2·2H2O,用類似方法(于75 ℃反應12 h。冷卻至室溫，用5%NaOH溶液調至pH 5.2)制得淡粉色粉末2。

2 結果與討論

2.1 配合物的IR分析

CTS, L, 1和2的IR分析結果見表1。由表1可見，CTS在1 658 cm-1處的吸收峰對應C=O的反對稱伸縮振動，在1 595 cm-1處的吸收峰對應N-H的變形振動。L在這兩處的吸收峰消失，而在1 630 cm-1處出現(xiàn)了C=N反對稱伸縮振動吸收峰，這是希夫堿酚亞胺的特征吸收；在1 580 cm-1, 1 498 cm-1和1 461 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)骨架振動特征吸收；在1 276 cm-1處出現(xiàn)酚羥基C-O彎曲振動吸收峰；指紋區(qū)752 cm-1處的銳峰為鄰位取代苯的特征吸收峰。1和2的酚亞胺吸收峰分別紅移至1 612 cm-1處和1 630 cm-1處，且吸收明顯減弱；1的酚羥基C-O彎曲振動吸收幾乎消失；2的酚羥基C-O彎曲振動吸收蘭移至1 277 cm-1且吸收明顯減弱[10]，說明C=N鍵中的氮原子和酚羥基上的氧原子同時參與了配位；而且1和2中苯環(huán)鄰取代的特征峰及苯環(huán)的骨架振動特征峰相對L都出現(xiàn)不同程度的位移，這表明Cu(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)均與L形成了配合物。

表 1 CTS, L, 1和2的IR數(shù)據(jù)Table 1 IR data of CTS, L, 1 and 2

2.2 配合物的UV分析

CTS, L, 1和2的UV譜圖見圖1。從圖1可以看出,CTS只在202 nm處有1個強而窄的吸收峰，在大于210 nm區(qū)域無明顯吸收。L有三個明顯的吸收峰，在324 nm處的吸收峰為酚亞胺C=N的吸收，歸屬于n→π*躍遷形成的R帶吸收峰，其特點是躍遷幾率小，吸收強度弱；255 nm處的吸收峰為芳香類化合物特有的B帶吸收帶，吸收強度中等；210 nm是酚亞胺C=N產(chǎn)生π→π*躍遷形成的K帶吸收峰，特點是吸收強度大。

λ/nm圖 1 CTS, L, 1和2的UV譜圖Figure 1 UV spectra of CTS, L, 1 and 2

L的特征吸收峰在1和2配合物中仍然存在，表明形成配合物后C=N雙鍵未被破壞，但均有不同程度的紅移，酚亞胺的R帶吸收峰分別紅移至335 nm和333 nm， K帶吸收峰分別紅移至218 nm和224m，各吸收峰的吸光強度也發(fā)生了不同程度的變化，顯示N→Cu(Ⅱ)鍵和N→Mn(Ⅱ)鍵的形成，這是由于C=N的N原子參與了配位，破壞了分子的有序性，從而使躍遷能級減小，吸收光譜發(fā)生了紅移，表明C=N的N原子參與了配位。這些結果與IR分析吻合。

2.3 配合物的熒光分析

CTS, L, 1和2的熒光光譜數(shù)據(jù)見表2。從表2可以看出，CTS, L, 1和2的最大激發(fā)波長(λex)在228.8 nm～230.1 nm，變化不大，但相對CTS和L而言，1和2的激發(fā)光譜強度有所增強，這可能是金屬離子參與配位后化合物共價性增強所致。相對CTS而言，L的最大發(fā)射波長(λem)發(fā)生了紅移。λem與物質結構中的有效共軛程度有關，有效共軛程度越高，λem越大，表明CTS經(jīng)水楊醛化學改性后的L中形成了許多酚亞胺C=N鍵，使整個分子結構的效共軛程度上升。這也充分證明水楊醛在CTS上接枝成功，生成了如Scheme 1預期的L。1和2的熒光光譜比較相似，說明它們的結構特征相似。由于CuCl2·2H2O和MnCl2·4H2O分別與L反應形成1和2后，分子電子云密度發(fā)生變化，平面度增加，π電子的共軛度增強，因而其λem與L相比均發(fā)生紅移，發(fā)光強度也明顯提高，這證實1和2的結構與Scheme 1預期一致。這些分析結果均與IR和UV一致。

表 2 CTS, L, 1和2的熒光光譜數(shù)據(jù)Table 2 Fluorescence data of CTS, L, 1 and 2

綜合IR, UV和熒光光譜分析結果，表明水楊醛與CTS的接枝產(chǎn)物為殼聚糖希夫堿L; L與CuCl2·2H2O和MnCl2·4H2O反應生成殼聚糖希夫堿金屬配合物時，C=N參與了配位。

2.4 配合物的熱重分析

CTS, L, 1和2的主要熱重數(shù)據(jù)見表3。CTS在100.00 ℃以下失去吸附水，在258.39 ℃～371.29 ℃失重90.339%，主要是CTS降解所致[10]。L的失重溫度范圍和失重比率相對CTS基本不變，即L在276.82 ℃～375.97 ℃降解，失重89.615%。1和2的熱行為比較相似，100 ℃以下的失重顯示配合物中結晶水的失去。相對而言， 1的開始分解溫度比CTS和L低，可能是由于L與銅配位后，其分子內的氫鍵結合被破壞，結晶度發(fā)生改變，熱穩(wěn)定性減小所致[11]。而2的開始分解溫度比CTS和L稍高，顯示L與金屬錳離子配位后，熱穩(wěn)定性有所改變。配合物的最終產(chǎn)物為相應的金屬氧化物CuO和MnO。1的熱分解殘留率34.01%(EDTA絡合滴定法測定CuO 31.71%);2的熱分解殘留率22.10%(MnO 21.51%),可見殘留率與配合物中金屬氧化物含量的測定值基本吻合。

表 3 CTS, L, 1和2的TGA數(shù)據(jù)Table 3 TGA data of CTS, L, 1 and 2

2.5 配合物的抑菌活性

培養(yǎng)基為水解酪蛋白胨肉湯，待測樣品均用1%HCl溶液配制?？咕钚詫嶒灢捎迷嚬芟♂尫y定最小抑菌濃度(MIC)[9]，實驗結果見圖2。由圖2可見，(1)1和2的最小抑菌濃度明顯小于相關對照; (2)對于同一種細菌而言，1和2的抗菌活性雖然有一定不同，但統(tǒng)計結果顯示沒有顯著差異; (3) 對于同一種配合物而言，抗菌活性對不同的菌種表現(xiàn)也不盡相同，1對大腸桿菌的MIC≤700 μg·mL-1，對沙門氏菌的MIC≤1 200 μg·mL-1。2對枯草桿菌的MIC≤2 400 μg·mL-1，對金黃色葡萄球菌的MIC≤900 μg·mL-1，總體來說，配合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用更為明顯。L與Cu(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)形成配合物后，均能對四種細菌產(chǎn)生抗菌活性，而且抗菌活性相對L得到提高，可能是因為L與金屬離子形成配合物后，其細胞滲透性相對較高，容易阻止或抑制細菌生長[13]；同時由于生物體內金屬離子容易與氧結合，能夠儲存、轉移、甚至進入特定的生物狀態(tài)，影響蛋白質、氨基酸、輔酶及脂蛋白的合成，并與蛋白質的某些成份形成穩(wěn)定的配合物，使蛋白質或酶變性[14，15]，從而對細菌起到了一定的抑制作用。雖然殼聚糖希夫堿配合物的抗菌機理仍有待于進一步探討，但從實驗結果可以看出這類配合物在抑菌、防腐等方面具有很大的潛在應用價值。

圖 2 化合物的抑菌活性*Figure 2 Antibacterial activities of compounds

*E.coli:大腸桿菌,B.subtilis:金黃色葡萄球菌,SE:沙門氏菌,SA:枯草桿菌;數(shù)據(jù)統(tǒng)計通過SPSS11.5 軟件處理，a, b, c, d, e表示數(shù)據(jù)之間的差別等級(置信度P=0.95,α=0.05),其中a～e表示數(shù)據(jù)由大到小，不同字母表示結果之間有顯著差異，相同字母表示結果之間無顯著差異

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