韓清華 劉文媛 李晨娟 王睿 史宏濤

UrotensinⅡ(尾加壓素Ⅱ，UⅡ)是最初從硬骨魚尾部的下垂體中被提取出的一種生長(zhǎng)抑素樣多肽［1］，主要分布于心血管及神經(jīng)系統(tǒng)［2，3］，它的縮血管效應(yīng)是內(nèi)皮素的 8～10倍［4］。Ames等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的孤兒受體 G 蛋白偶聯(lián)受體14(G-protein coupled receptor 14，GPR14，UT)是 UⅡ的特異性受體。UⅡ與UT結(jié)合后，可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌纖維細(xì)胞的增殖、強(qiáng)烈的收縮血管作用及心臟抑制等心血管效應(yīng)。其作用途徑很多，可能有鈣(Ca2+)、磷脂酶、酪氨酸激酶、RhoA等因子參與［6］，但具體通過哪條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮效應(yīng)尚不清楚。本研究利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察UⅡ?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞L-型鈣電流的影響，并選用特異性 PKA拮抗劑-KT5720，研究KT5720對(duì)UⅡ作用的阻斷效應(yīng)，進(jìn)而闡明UⅡ作用于大鼠心臟效應(yīng)的可能電生理機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，♂，體重200～250 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑:UrotensinⅡ(human)與KT5720購(gòu)自英國(guó)TOCRIS公司;?；撬?taurine)、L-谷氨酸(L-glutamic acid)、乙二醇四乙酸(EGTA)、HEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;膠原酶P(Collagenase P)購(gòu)自德國(guó)Bochringer Mannhein公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 單個(gè)心室肌細(xì)胞的急性分離 取大鼠擊頭致昏，迅速剪斷頸部放血，開胸取出心肺，立即置于0℃氧飽和的無鈣臺(tái)式液中修剪，然后將心臟掛在Langendorff灌流裝置上經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流，流速2 ml/min。先用無鈣臺(tái)式液灌流7～8 min，再用酶液循環(huán)灌流15～20 min。灌流過程中保持37℃恒溫，灌流壓為70 cmH2O，并持續(xù)通以100%氧氣。待心臟組織變大、變軟后將左心室肌組織剪下來，置于KB液中輕柔吹打，得到分散的心室肌細(xì)胞，經(jīng)150 μm孔徑的濾網(wǎng)過濾后保存于KB液中，室溫下穩(wěn)定1 h后，放入4℃冰箱靜置2 h備用。

1.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄 實(shí)驗(yàn)前先將存放于KB液中的心室肌細(xì)胞復(fù)鈣，復(fù)鈣終濃度為1.8 mmol/L。吸取適量細(xì)胞懸液滴加于灌流槽中，放置5～10 min使細(xì)胞牢固貼壁后，用細(xì)胞外灌流液以1～2 ml/min勻速灌流，使細(xì)胞逐漸復(fù)鈣，10～20 min后，于倒置相差顯微鏡下選擇貼壁牢固、無跳動(dòng)、橫紋清晰、折光性好、立體感強(qiáng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。玻璃微電極由PP-83型二步拉制儀(Narishige Co，Japan)拉制而成，充灌電極內(nèi)液后，電極電阻為2～5 mΩ。用微電極操縱器(Narishige Co，Japan)將電極推向細(xì)胞，負(fù)壓吸引形成高阻封接，電擊破細(xì)胞膜，補(bǔ)償電容電流和串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞記錄模式記錄ICa-L。細(xì)胞破膜后5 min開始記錄Ica-L，電流值以電流密度(pA/pF)表示。以上記錄均在室溫下進(jìn)行。信號(hào)經(jīng)Axopatch-200B膜片鉗放大器放大、Digidate 1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換，通過pClamp8.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、儲(chǔ)存及分析。

L-型鈣電流記錄:在全細(xì)胞模式下，用TEA-Cl、CsCl阻斷電壓依賴性的Ik，從鉗制電位-40 mV開始，以10 mV步階逐步去極化至+50 mV，電壓刺激時(shí)程為300 ms，刺激頻率為0.1 Hz激活I(lǐng)ca-L。心肌細(xì)胞分離及全細(xì)胞電流記錄方法參照文獻(xiàn)。

1.4 溶液組成 臺(tái)氏液(mmol/L):KCl 5.4;NaH2PO40.33;HEPES 5.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;NaCl 140;CaCl21.8;用NaOH調(diào)pH值到7.35～7.40。無鈣臺(tái)氏液:去除鈣離子的臺(tái)式液。酶液(mmol/L):KCl5.4;NaH2PO40.33;HEPES 5.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;NaCl 125;Taurine 20.0;CaCl275 μmol/L;膠原酶P 5～7 mg。KB液(mmol/L):L-谷氨酸50.0;KCl 30.0;?；撬?0.0;KH2PO430.0;HEPES 10.0;Glucose 10.0;MgCl21.0;EGTA 0.5;用KOH調(diào)pH值到7.35～7.40。

L-型鈣電流(Ica-L)的電極內(nèi)液(mmol/L):KCl 150;HEPES 5.0;EGTA 5.0;K2ATP 3.0;MgCl21.0;4-AP 5.0;MgATP 1.0，;用KOH調(diào)pH值到7.3。細(xì)胞外灌流液為臺(tái)式液。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 原始數(shù)據(jù)經(jīng)Clampfit處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較用方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UⅡ?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞Ica-L的影響

2.1.1 不同濃度的UⅡ?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞Ica-L的影響 10-9～10-5mol/L UⅡ灌流5 min后，UⅡ呈濃度依賴性的抑制大鼠心肌細(xì)胞Ica-L，10-6和10-5mol/L UⅡ的下降率明顯大于對(duì)照組(P＜0.01，n=10)(圖1)。

圖1 10-9～10-5mol/L UⅡ灌流后，UⅡ呈濃度依賴性的抑制大鼠心肌細(xì)胞Ica-L

2.1.2 不同濃度UⅡ?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞L-型鈣電流密度的影響(表1，圖2)

表1 不同濃度UⅡ?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞L-型鈣電流密度的影響

2.2 KT5720對(duì)UⅡ作用于大鼠心肌細(xì)胞Ica-L的影響(圖2)。

圖2 灌流KT-5720基礎(chǔ)上給予UⅡIca-L變化不明顯

3 討論

UⅡ是迄今為止發(fā)現(xiàn)的收縮血管活性最強(qiáng)的物質(zhì)，可引起心功能抑制、心肌收縮力減弱等心血管效應(yīng)。因此，UII對(duì)心血管系統(tǒng)的效應(yīng)仍是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。本課題組在前期研究中，利用Langendorff離體大鼠心臟模型，用不同濃度的UⅡ(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)依次灌注正常大鼠心臟，±dp/dtmax抑制率隨濃度增加而增大，呈劑量依賴性抑制作用。

為進(jìn)一步探討UⅡ作用于心臟的電生理機(jī)制，本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察到UⅡ呈濃度依賴性的抑制大鼠左心室心肌細(xì)胞Ica-L。正常狀態(tài)下心室肌細(xì)胞L-型鈣通道開放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+誘導(dǎo)的鈣釋放機(jī)制引起鈣池釋放鈣，從而使胞漿內(nèi)Ca2+水平升高，引起心肌收縮。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到UⅡ能減弱心肌細(xì)胞L-型鈣電流強(qiáng)度，抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而抑制心肌收縮。因此我們推測(cè)UⅡ?qū)π墓δ艿囊种谱饔檬桥c抑制鈣電流有關(guān)。

目前研究顯示UⅡ與其受體結(jié)合后的作用途徑很多，可能有鈣(Ca2+)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)、磷酸肌醇、酪氨酸激酶、小型的 GTP酶RhoA及效應(yīng)器Rho激酶-RhoK等因子參與，但具體通過哪條途徑發(fā)揮效應(yīng)尚有爭(zhēng)議，因此UⅡ?qū)π难芟到y(tǒng)的作用轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。本研究選用特異性PKA拮抗劑-KT5720，在單個(gè)心肌細(xì)胞L-型鈣電流的記錄中，觀察到在灌流KT-5720基礎(chǔ)上給予UⅡ，L-型鈣電流密度峰值變化不明顯，表明KT-5720可阻斷UⅡ?qū)︹}電流的抑制作用。由此我們推測(cè)，UrotensinⅡ可能通過PKA途徑抑制心肌細(xì)胞L-型鈣電流而發(fā)揮其心功能抑制作用。

UⅡ作為收縮血管活性最強(qiáng)的物質(zhì)，目前已成為心血管疾病治療的潛在的靶點(diǎn)。但是UⅡ作用非常廣泛而且復(fù)雜，其生物學(xué)作用還有待于進(jìn)一步的研究。

［1］David P.Johne S，Brianr C.et al.Urotensin Ⅱ:A somatostatinlike peptide in the caudal neurosecretory system of fishes.Proc Natl Acad Sci，1980，77(8):5021.

［2］Zhu Y C，Zhu Y Z，Moore P K.The role of urotensin II in cardiovascular and renal physiology and diseases.Br J Pharmacol，2006，148(7):884-901.

［3］Zhu X M，Du G H.Progress in the study of biological activities of urotensinⅡ.Chin Pharmacol Bull，2006，22(6):651-4.

［4］Tasaki K，Hori M，Ozaki H，Karaki H，Wakabayashi I.Mechanism of human urotensin II-induced contraction in rat aorta.J Pharmacol Sci，2004，94(4):376-83.

［5］Ames RS，Sarau HM，Chambers JK，et al.Human urotensinⅡis a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14.Nature，1999，402(6764):898-903.

［6］Maguire J J，Davenport A P.Is urotensin-Ⅱ the new endothelin?.Br J Pharmacol，2002，137(5):579-588.

［7］Yazawa K，Kaibara M，Ohara M，et al.An improved method for isol-ating cardiac myocytes useful for pathch-clamp studies.Jpn J Physiol，1990，40:157-163.