牛曉明

卵巢組織的冷凍保存是女性生殖保險的一種新方法。本研究分別采用玻璃化冷凍法及慢速程序冷凍法，將人類卵巢組織冷凍保存，解凍后對組織切片進行光鏡及卵泡凋亡觀察，比較不同冷凍保護方案對人類卵巢組織的保護作用，探究玻璃化法冷凍保存人類卵巢組織的可行性。

1 材料和方法

1.1 卵巢組織來源及處理 卵巢組織來自2009年7月至2010年7月期間，泰安市中心醫(yī)院生殖遺傳科因各種原因需部分卵巢組織的育齡期女性，共計19例。獲取的卵巢組織用含5%人血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液反復清洗后，去除卵巢髓質、脂肪等雜質部分，僅留卵巢皮質并切割成約切成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，隨機分為3組:玻璃化冷凍組、程序冷凍組、新鮮對照組。

1.2 主要試劑 丙二醇(PRHO)、乙二醇(EG)、二甲基亞砜(DMSO)、蔗糖(S)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國Sigma公司，人血清白蛋白(HSA)購自瑞典Vitrolife公司

1.3 冷凍復蘇方案

1.3.1 玻璃化冷凍 冷凍方法:卵巢組織塊在冷凍基礎液(PBS+10%HSA)的培養(yǎng)皿中平衡10 min后，進行三步滲透平衡:①卵巢組織塊在冷凍液1(0.35 mol/L DMSO+0.38 mol/L PROH+0.38 mol/L EG+冷凍基礎液)的培養(yǎng)皿中平衡10 min。②4℃條件下卵巢組織塊在含冷凍液2(0.7 mol/L DMSO+0.75 mol/L PROH+0.75 mol/L EG+冷凍基礎液)的培養(yǎng)皿中平衡10 min。③4℃條件下卵巢組織塊在含冷凍液3(1.4 mol/L DMSO+1.5 mol/L PROH+1.5 mol/L EG+10%PVP的冷凍基礎液)的培養(yǎng)皿中平衡10 min。卵巢組織從冷凍液3中取出后，轉入開放式0.5 ml麥管中，然后將含有玻璃化冷凍組織的麥管置入預冷的5 ml冷凍管中后投入液氮中保存。復溫方法:①麥管從冷凍管中取出后直接置入37℃預熱的(PBS+10 mg/ml HSA+0.5 mol/L S)中置換5 min。②取出的卵巢組織在含有解凍液(PBS+10 mg/ml HSA+0.25 mol/L S)的培養(yǎng)皿中置換5 min。③取出的卵巢組織在含有解凍液(PBS+10 mg/ml HSA+0.125 mol/L S)的培養(yǎng)皿中置換5 min。④取出的卵巢組織在含有解凍液(PBS+10 mg/ml HSA)的培養(yǎng)皿中置換5 min。

1.3.2 慢速程序冷凍 冷凍方法參考Newton等［1 2］的慢速程序冷凍法:將卵巢組織投入含1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L S+10 mg/ml HSA的PBS液中，室溫平衡90 min，裝入0.5 ml冷凍管中放于程序冷凍儀上，從室溫開始以2℃/min降至-7℃，人工植冰，再以0.3℃/min的降溫速率降至-30℃，以10℃/min的降溫速率降至-120℃，投入液氮中冷凍保存。復溫方法:將冷凍管自液氮罐中取出，置入37℃水浴箱中2-3 min，室溫中按含1.0 mol/L PROH、0.5 mol/L PROH的 PBS液梯度遞減洗脫冷凍保護劑各三遍，將組織移入含5%HSA的PBS液中完成復溫。

1.4 凍融后卵巢組織結構分析

1.4.1 新鮮及凍融卵巢組織的組織學觀察 光鏡下觀察各級卵泡及卵巢間質細胞的結構形態(tài)學改變，計數(shù)形態(tài)正常和異常的間質細胞、始基卵泡和初級卵泡。為避免重復計數(shù)，每間隔10個組織切片分析一次。

1.4.2 人類卵巢組織內卵泡凋亡情況觀察 采用TUNEL實驗來觀察卵泡的凋亡情況。實驗步驟按照產品說明書進行。切片在光鏡隨機選取10個視野，計數(shù)全部及凋亡卵泡數(shù)，計算凋亡卵泡率。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。樣本率的比較采用Fisher's確切概率法或χ2檢驗。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 凍融后卵巢組織的形態(tài)學觀察 卵巢組織中形態(tài)正常的卵泡表現(xiàn)為卵泡及卵母細胞呈圓形，卵母細胞膜完整，細胞核形態(tài)正常。形態(tài)異常的卵泡表現(xiàn)為卵泡和卵母細胞形態(tài)失常，皺縮，卵母細胞漿內出現(xiàn)較多空泡，細胞核固縮，卵母細胞外周顆粒細胞不完整。形態(tài)異常的間質細胞主要表現(xiàn)為細胞核固縮。慢速程序冷凍組的異常卵巢間質細胞比率高于玻璃化冷凍組和新鮮對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，玻璃化冷凍組與新鮮對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各冷凍組的異常始基卵泡及初級卵泡比率均高于新鮮對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各冷凍組間差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表1、2。

表1 不同冷凍方案卵巢間質細胞形態(tài)學的改變

表2 不同冷凍方案卵泡形態(tài)學的改變

2.2 凍融卵巢組織中卵泡凋亡比值 3組中共計數(shù)了169個卵泡，凋亡卵泡比值分別為23.3%(10/43)、21.9%(9/41)、18.9%(11/37)組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 不同冷凍方案卵泡卵泡凋亡率比較

3 討論

放射療法及化學藥物療法的生殖細胞毒性作用，可導致女性惡性腫瘤患者卵巢功能衰竭［3］。為生殖保險而進行的人類卵巢組織冷凍保存已成為生殖醫(yī)學研究的熱點。傳統(tǒng)慢速程序冷凍法過程繁瑣，需要昂貴的程序冷凍儀，且對卵巢組織的間質細胞保護效果欠佳［4］。有別于慢速程序冷凍法在降溫的冷凍過程中會形成冰晶，進而造成對組織的傷害，玻璃化冷凍技術的特點是使細胞本身及冷凍溶液在冷凍時，呈現(xiàn)黏稠而不產生結晶的玻璃化狀態(tài)，以改善慢速冷凍之缺點［5］。Miyamoto H 等［6］通過玻璃化冷凍大鼠卵巢后，觀察到卵巢形態(tài)學結構保存良好。Isachenko等［7］采用乙二醇+蔗糖+蛋黃混合液作為玻璃化液，采用液氮直投法冷凍保存人類卵巢組織。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢組織中的始基卵泡和初級卵泡可以得到很好地保存。本研究聯(lián)合應用DMSO、EG、PROH，采用了三步滲透法，逐漸增加玻璃化冷凍保護劑濃度。為減小DMSO毒性，本研究在4℃下進行第二、三步平衡。并在第三步平衡時添加了PVP，PVP可以優(yōu)先同溶液中水分子結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成。同時，由于其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷［8］。在冷凍過程中，我們使用了經過開放式的冷凍麥管，盡可能減少組織周圍的液體容積，最大限度提高組織冷凍速度。復溫溶解時，解凍液中的蔗糖，提供了一個細胞外高滲環(huán)境，防止細胞腫脹造成的滲透休克［9］。

Demirci等［10］認為卵巢組織冷凍保存后，卵泡DNA損傷增加。本研究應用TUNEL實驗來觀察DNA受損情況，發(fā)現(xiàn)冷凍組和對照組的卵泡凋亡率無統(tǒng)計學差異，證實玻璃化冷凍并不會造成卵泡DNA的損傷。

本研究證實采用DMSO、EG、PROH、PVP等作為冷凍保護劑，三步滲透平衡的玻璃化法，其冷凍保存人類卵巢組織中的始基卵泡和初級卵泡的功效與傳統(tǒng)慢速程序法相似，對卵巢間質的保護優(yōu)于慢速程序冷凍法。不會造成卵泡DNA的損傷，且具有冷凍步驟簡單，無須昂貴、復雜的冷凍設備等優(yōu)點，是適宜的人類卵巢組織冷凍保存的方法。

［1］Newton H，Aubard Y，Rutherford A，et al.Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue.Hum Reprod，1996，11(7):1487-1491.

［2］Newton H，F(xiàn)isher J，Arnold JR，et al.Permeation of human ovarian tissue with cryoprotective agents in preparation for cryopreservation.Hum Reprod，1998，13(2):376-380.

［3］Meirow D，Nugent D.The effects of radiotherapy and chemotherapy on female reproduction.Hum Reprod update，2001，7(6):535-543.

［4］Hreinsson J，Zhang P，Swahn ML，et al.Cryopreservation of follicles in human ovarian cortical tissue.Hum Reprod，2003，18(11):1-9.

［5］Dela Pena EC，Takahashi Y，Katagiri S，et al.Birth of pups after transfer of mouse embryos derived from vitrified preantral follicles.Reproduction 2002，123(4):593-600.

［6］Miyamoto H，Sugimoto M.Assessment of follicle development and histo cytological examination of neonatal rat ovaries cryopreserved by vitrification technique.Cryobiology，1994，31:614-615.

［7］Isachenko E，Isachenko V，Rahimi G，et al.Cryopreservation of hu-man ovarian tissue by direct plunging into liquid nitrogen.Eur J Obstet Gy-necol Reprod Biol，2003，108(2):186-193.

［8］Victoria Keros1，Susanna Xella，Kjell Hultenby，et al.Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue.Human Reproduction，2009，24(7):1670-1683.

［9］Oktay K，Economos K，Kan M，et al.Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.JAMA，2001，286(12):1490-1493.

［10］Demirci B，Salle B，F(xiàn)rappart L，et al.Morphological alterations and DNA fragmentation in occytes from primordial and primary follicles after freezing-thawing of ovarian cortex in sheep.Fertil Steril 2002，77(3):595-600.