羅 強(qiáng) 孫 黎 張淑萍 李 旺 張林西 (河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 張家口 075000)

肺康飲口服液對(duì)Ncl-H446細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響

羅 強(qiáng) 孫 黎 張淑萍1李 旺1張林西 (河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 張家口 075000)

目的 通過(guò)觀察肺康飲口服液對(duì)人小細(xì)胞肺癌Ncl-H446生長(zhǎng)及凋亡的影響，探討其體外的抗腫瘤效應(yīng)。方法 體外培養(yǎng)Ncl-H446細(xì)胞，以不同濃度的肺康飲口服液作用為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)對(duì)照組，CCK8法測(cè)細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)、透射電鏡觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ncl-H446細(xì)胞凋亡。結(jié)果 不同濃度肺康飲口服液作用Ncl-H446細(xì)胞24 h增殖抑制明顯(P＜0.05)，其抑制效應(yīng)具有劑量依賴的特點(diǎn);電鏡及流式顯示Ncl-H446細(xì)胞凋亡。結(jié)論 肺康飲口服液可抑制Ncl-H446細(xì)胞的生長(zhǎng)且增殖抑制效應(yīng)具有劑量依賴性，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

肺康飲口服液;Ncl-H446;CCK-8

肺癌是目前公認(rèn)的全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，而且其較高的死亡率和較低的治愈率一直以來(lái)都是臨床較難攻克的一道難題〔1〕。小細(xì)胞肺癌常見于老年人，是一種全身性疾病，治療以化療為主，但老年患者由于特殊的身體條件，不能耐受常規(guī)劑量的化療，目前對(duì)于老年人小細(xì)胞肺癌的治療，文獻(xiàn)報(bào)道仍存在分歧〔2，3〕。肺癌按組織病理分型主要分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中SCLC的癌細(xì)胞體積雖然很小，但是，卻是各類肺癌中惡性程度最高、預(yù)后極差的一種〔4〕。有很多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥性的產(chǎn)生通常都伴有凋亡抑制現(xiàn)象〔5〕。肺康飲是由竹葉、桑葉等數(shù)位中藥組成的中藥復(fù)方，經(jīng)臨床觀察對(duì)肺癌患者有一定的療效〔6〕，但作用機(jī)制還不清楚。為此本研究主要通過(guò)肺康飲口服液對(duì)人小細(xì)胞肺癌增殖與凋亡作用來(lái)探討其作用機(jī)制并為肺康飲口服液進(jìn)一步研究開發(fā)與臨床治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株Ncl-H446由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)遺傳室惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(天津市川頁(yè)生化制品有限公司)，CCK-8(上海同仁化學(xué))，瓊脂糖、100 bp DNA marker(北京六和同公司)，細(xì)胞周期試劑盒(美國(guó)BD公司)。美國(guó)SpectraMax M2e多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)，美國(guó) FACSA ria流式細(xì)胞儀，日本電子100CS-Ⅱ型透視電鏡，LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)。

1.2 肺康飲口服液的制備

肺康飲口服液按水煎醇沉法制備而成，生藥含量為1 g/ml，pH7.0，以0.22 μm微孔濾器過(guò)濾除菌，分裝4℃保存。使用時(shí)以培養(yǎng)液稀釋至所需藥物濃度。

1.3 Ncl-H446細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用不同濃度肺康飲口服液處理。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期密度為5×104/ml的Ncl-H446細(xì)胞，接種于 96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔。用DMEM培養(yǎng)液將肺康飲口服液稀釋成2.379，1.586，1.269，0.793，0.476 mg/ml 5個(gè)不同濃度，分別加入96孔培養(yǎng)板(100 μl/孔)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。然后每孔加入CCK-8 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后用SpectraMax M2/M2e多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)吸光度(A490值)，按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率;抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A490值/對(duì)照組平均A490值)×100%。

1.5 電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及凋亡情況

細(xì)胞(密度為1×106/ml)分別接種于4個(gè)50 ml的培養(yǎng)瓶中，貼壁后換不同濃度的肺康飲口服液培養(yǎng)液(0.793，1.269，1.586 mg/ml)、并設(shè)對(duì)照，作用5 h后，收集細(xì)胞，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、染色，進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ncl-

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Ncl-H446

細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM H446細(xì)胞，加入上述不同濃度肺康飲口服液培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心7 min，PBS洗滌2次，配成1×106/ml細(xì)胞懸液，70%冰乙醇-20℃固定，上機(jī)測(cè)定前，離心去乙醇，用PBS洗滌2次，用0.5 ml PBS懸浮細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入PI染液0.5 ml，4℃避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺康飲口服液對(duì)Ncl-H446細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測(cè) 2.379，1.586，1.269，0.793，0.476 mg/ml 5 個(gè)不同濃度的肺康飲口服液作用Ncl-H446細(xì)胞24 h，對(duì) Ncl-H446細(xì)胞的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，并隨著肺康飲口服液濃度的增加，對(duì)Ncl-H446細(xì)胞抑制率也增加，分別為11.28%、21.00%、52.62%、68.00%、78.45%。其增殖抑制效應(yīng)具有明顯的量效關(guān)系(P＜0.05)。見表1。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組肺癌細(xì)胞表面有很多微絨毛，胞質(zhì)內(nèi)有較豐富的細(xì)胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等清晰可見。核圓形，核膜清晰，核內(nèi)染色質(zhì)呈細(xì)沙粒狀，異染色至少。核仁大;給藥組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，核體積變小，染色體邊集合膜下，核膜清晰，細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)呈凋亡早期的改變，部分壞死細(xì)胞膜斷裂，細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)消失，胞質(zhì)內(nèi)被大量脂滴所充填，少量細(xì)胞核固縮形成高電子斑塊邊集合膜下，細(xì)胞表面伸出長(zhǎng)的突起，細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)為凋亡晚期的改變。見圖1。

表1 肺康飲口服液對(duì)Ncl-H446細(xì)胞增殖的影響

圖1 不同濃度的肺康飲作用小細(xì)胞肺癌后，電鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變(×5 800)

2.3 肺康飲口服液對(duì)Ncl-H446細(xì)胞周期的影響

1.586、1.269、0.793、0.476 mg/ml肺康飲口服液處理的 Ncl-H446細(xì)胞，均出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體的凋亡峰，其峰值(即凋亡細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值)隨肺康飲口服液濃度增高逐漸增高，其峰值分別為 5.53%、7.12%、10.34%、21.14%及29.68%。對(duì)照組無(wú)亞二倍體凋亡峰。

經(jīng)2.379、

3 討論

小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的20%左右，遠(yuǎn)期療效不佳。雖然化療是治療該病的主要手段之一，但有關(guān)老年人小細(xì)胞肺癌治療的研究報(bào)道不多，常被排除在治療和研究之外〔7，8〕。小細(xì)胞肺癌為中老年疾病，尤以老年人多見，隨著世界人口老齡化趨勢(shì)的加重，老年小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)〔9〕。從細(xì)胞動(dòng)力學(xué)觀點(diǎn)看，該型肺癌生長(zhǎng)迅速，倍增時(shí)間短〔10〕。

腫瘤的發(fā)生有其遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為多基因突變所致的細(xì)胞失控性生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡受阻是其發(fā)生、發(fā)展的主要原因〔11〕。細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡(PCD)，即有核細(xì)胞在一定條件下啟動(dòng)自身的內(nèi)部機(jī)制使得內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶激活而引起的細(xì)胞死亡過(guò)程，即受基因、信使調(diào)控的單個(gè)細(xì)胞自殺過(guò)程〔12〕。細(xì)胞凋亡有別于壞死細(xì)胞主動(dòng)性自殺，是受多基因控制的有序性死亡過(guò)程。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和進(jìn)一步闡明凋亡的基因調(diào)控機(jī)制，是目前腫瘤治療新的研究熱點(diǎn)〔13〕。凋亡最突出的生化特征是內(nèi)源性Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活化在和小體連接區(qū)切割DNA雙鏈，使DNA降解成200 bp或其整數(shù)倍的寡核苷酸片段。細(xì)胞出現(xiàn)凋亡時(shí)，出現(xiàn)明顯的核固縮、凝聚、斷裂，膜出泡，形成凋亡小體;經(jīng)流式細(xì)胞儀DNA定量分析圖出現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡峰。目前所發(fā)現(xiàn)的能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的西藥很多，但由于毒副作用較大而應(yīng)用受到一定限制，因此中藥誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡受到越來(lái)越多的關(guān)注〔14〕。

肺康飲口服液作為常見的損傷性誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡其主要作用是引起CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞的缺失，阻斷部分蛋白酶的活化或者抑制它們的功能〔15，16〕。為闡明肺康飲口服液的抗腫瘤作用機(jī)制，本研究采用透射電鏡鏡形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ncl-H446細(xì)胞凋亡特征，從而證實(shí)肺康飲口服液抗腫瘤細(xì)胞(Ncl-H446)機(jī)制是誘導(dǎo)其凋亡。實(shí)驗(yàn)中CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示肺康飲口服液作用Ncl-H446細(xì)胞的增殖抑制作用存在明顯的量效關(guān)系，且隨著濃度增加抑制率明顯增強(qiáng)。

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Effects of Feikangyin oral liquid on growth and apoptosis of Ncl-H446 cells

LUO Qiang，SUN Li，ZHANG Shu-Ping，et al.
Central Laboratory，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China

Objective To observe the Feikangyin oral liquid on growth and apoptosis of Ncl-H446 and explore the anti-tumor effect in vitro.Methods Ncl-H446 cells were cultured in vitro with different concentrations of Feikangyin in experimental and the control groups.Cell proliferation was measured by CCK8 method.Cell morphology was observed by transmission electron microscopy.Flow cytometry was used to detect the protein expression in Ncl-H446 cells.Results Effects of different concentration of Feikangyin at 24 h on Ncl-H446 cell growth inhibition were significant(P＜0.05)，and the inhibitory effect had a dose-dependent characteristics.Flow cytometry and transmission electron microscopy showed that Feikangyin could induce Ncl-H446 cells apoptosis.Conclusions Feikangyin could inhibit the growth of Ncl-H446 cells，the inhibition has a dose-dependent，could induce tumor cell apoptosis.

Feikangyin;Ncl-H446;CCK-8

R393

A

1005-9202(2012)23-5206-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.047

河北省科技廳項(xiàng)目(No.062761618)

1 河北北方學(xué)院中醫(yī)教研室

羅 強(qiáng)(1977-)，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。

〔2011-05-26收稿 2012-01-10修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)