楊利敏 姚海濤 張曉波 趙 華 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 54007)

韁核損毀降低外源性抑郁癥大鼠室旁核促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的表達(dá)

楊利敏 姚海濤 張曉波 趙 華1(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討韁核與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸及抑郁癥之間的關(guān)系。方法 應(yīng)用慢性溫和性刺激誘導(dǎo)抑郁癥大鼠模型，觀察韁核損毀對(duì)抑郁癥大鼠行為、血清皮質(zhì)醇及下丘腦室旁核內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)表達(dá)的影響。結(jié)果 經(jīng)歷慢性不可預(yù)知性刺激后，大鼠在開(kāi)野實(shí)驗(yàn)中的水平活動(dòng)次數(shù)及直立次數(shù)明顯減少(P＜0.01);在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，上竄時(shí)間縮短(P＜0.01);放射免疫學(xué)結(jié)果顯示血清皮質(zhì)醇水平顯著升高(P＜0.01)，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示下丘腦室旁核內(nèi)CRH表達(dá)增加。損毀韁核后，抑郁癥大鼠在開(kāi)野實(shí)驗(yàn)中的水平及直立次數(shù)明顯增加(P＜0.01);強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯縮短，上竄時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.01);血清皮質(zhì)醇水平下降(P＜0.05);下丘腦室旁核內(nèi)CRH表達(dá)減少。結(jié)論 韁核損毀可改善抑郁癥大鼠的抑郁行為，對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能的調(diào)節(jié)可能是實(shí)現(xiàn)這一作用的機(jī)制之一。

抑郁癥;韁核;皮質(zhì)醇;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素;室旁核

韁核是位于邊緣前腦和腦干之間的一個(gè)重要核團(tuán)，除接受前腦等區(qū)域的傳入纖維投射，還發(fā)出傳出纖維投射到背側(cè)中縫核、黑質(zhì)及下丘腦等部位，具有廣泛的纖維投射。韁核參與了痛覺(jué)、心血管功能活動(dòng)等多種生理功能的調(diào)節(jié)，尤其是外側(cè)韁核與情緒、認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)具有密切關(guān)系。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)對(duì)應(yīng)激反應(yīng)中神經(jīng)、內(nèi)分泌及行為改變具有重要的整合作用〔1，2〕。有研究表明，抑郁癥病人腦內(nèi)CRH水平及外周血清皮質(zhì)醇水平均明顯高于正常人〔3〕，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔4〕。CRH在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用，而韁核可能是治療抑郁癥的一個(gè)重要的潛在的靶點(diǎn)，本文擬探討韁核與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與造模

采用健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠，體重180～210 g。由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物模型根據(jù)文獻(xiàn)方法稍加改進(jìn)。首先用開(kāi)野實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為評(píng)分，選擇得分相近的動(dòng)物，隨機(jī)分為空白組(8只)、模型組(30只)。應(yīng)用禁食、禁水、隔離、光照等不同的慢性刺激，每天隨機(jī)實(shí)施上述慢性應(yīng)激刺激，持續(xù)21 d，制備抑郁動(dòng)物模型。(1)開(kāi)野實(shí)驗(yàn)行為測(cè)定：用一個(gè)100 cm×100 cm×20 cm的敞箱，白色地面用黑筆畫(huà)成25個(gè)方格。沿墻為外周格，其余為中央格。室內(nèi)為暗光，將動(dòng)物入中央格，觀察5 min的活動(dòng)情況。每次在同一時(shí)間段進(jìn)行觀察。(2)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：在慢性應(yīng)激的第20天進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。把大鼠分別放進(jìn)水溫23℃ ～27℃，水深18 cm的玻璃缸中(40 cm×18 cm)，使大鼠后肢不能靠玻璃缸底部支撐身體。該實(shí)驗(yàn)由兩部分組成：先進(jìn)行15 min預(yù)游，24 h后觀測(cè)5 min的游泳行為，記錄不動(dòng)時(shí)間、游泳時(shí)間和上竄時(shí)間。

慢性應(yīng)激21 d后的大鼠，先進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，觀察與空白組相比，模型組大鼠的不動(dòng)時(shí)間是否延長(zhǎng)，出現(xiàn)行為絕望表現(xiàn)。然后挑選出不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)的大鼠，隨機(jī)分為抑郁癥模型組、抑郁癥+韁核損毀組和抑郁癥+假手術(shù)組，每組8只。

1.2 外側(cè)韁核損毀

麻醉動(dòng)物。待動(dòng)物角膜反射消失后進(jìn)行腦部手術(shù)。將大鼠固定于腦立體定位儀上。在腦正中線兩側(cè)的外側(cè)韁核所在部位(B：-3.3 mm ～3.5 mm，LR：0.5 mm，H：3.5 mm ～4.0 mm)，用牙科鉆鉆孔。鉆完孔后，用彎針頭小心挑除殘留的骨片，以免下電極時(shí)碰彎電極影響位置準(zhǔn)確性。然后調(diào)整定位儀，使同心圓電極位于韁核所在部位，垂直下電極，使其抵達(dá)深4.0 mm位置。將電子刺激器的電流輸出端與電極連接，給予1 mA電流1 min，電損毀外側(cè)韁核。外側(cè)韁核損毀后第3天，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。觀察外側(cè)韁核損毀對(duì)不動(dòng)時(shí)間、游泳時(shí)間和上竄時(shí)間的影響。

1.3 放免技術(shù)

皮質(zhì)醇放射免疫測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所，由專業(yè)技術(shù)人員嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。利用γ計(jì)數(shù)器(XH-6020γ免疫計(jì)數(shù)器：中國(guó)核工業(yè)總公司西安二六二廠)進(jìn)行讀數(shù)并打印結(jié)果。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

將大鼠斷頭處死，迅速解剖取大腦，置入固定液(10%中性甲醛)中固定6 h，取出后依次脫水、透明、浸蠟及包埋，制成5 μm石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。玻片經(jīng)APES處理，采用HistostainTM-SP法。切片經(jīng)烤片、脫蠟、脫水，3%甲醛-H2O2處理，蒸餾水洗。切片置于枸櫞酸緩沖液中微波抗原修復(fù)20 min，自然冷卻PBS沖洗5 min×3次，滴加5%BAS封閉37℃、20 min，甩去多余的5%BAS。滴加相應(yīng)多克隆抗體CRF 4℃孵育過(guò)夜 ，PBS沖洗5 min×3次，滴加生物素化羊抗兔 IgG 37℃、20 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加SABC 37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。脫水、透明、封片。顯示棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。

用10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測(cè)

在大鼠經(jīng)過(guò)慢性不可預(yù)知性刺激21 d后，大鼠在5 min開(kāi)野實(shí)驗(yàn)中的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)和直立次數(shù)均較刺激前明顯下降，具有顯著性差異，在5 min強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)慢性刺激后大鼠的不動(dòng)時(shí)間較明顯延長(zhǎng)，上竄時(shí)間較刺激前明顯縮短，二者均有顯著性差異。說(shuō)明慢性刺激后大鼠對(duì)周圍環(huán)境失去了興趣，出現(xiàn)了絕望的行為。而損毀韁核后大鼠的活動(dòng)度較損毀前明顯增加，在開(kāi)野實(shí)驗(yàn)中的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)和直立次數(shù)均較損毀前明顯增加(P＜0.01)。同樣，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中大鼠的不動(dòng)時(shí)間較損毀前明顯縮短，上竄時(shí)間較損毀前顯著增加(P＜0.01)。抑郁癥大鼠的抑郁行為得到了明顯改善。假手術(shù)組大鼠在開(kāi)野實(shí)驗(yàn)中的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)和直立次數(shù)與抑郁癥模型組大鼠相比無(wú)明顯改變;同樣，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的假手術(shù)組大鼠的不動(dòng)時(shí)間和上竄時(shí)間與抑郁癥模型組大鼠相比不動(dòng)時(shí)間不但沒(méi)有縮短反而有所延長(zhǎng)，上竄時(shí)間也有所減少，手術(shù)不但沒(méi)有改善反而加重抑郁行為，因此，可以排除手術(shù)改善大鼠抑郁行為的因素，說(shuō)明韁核損毀組大鼠抑郁行為的改善完全是因?yàn)轫\核損毀所致。見(jiàn)表1。

2.2 各組血清皮質(zhì)醇水平比較

抑郁癥模型組大鼠血清皮質(zhì)醇濃度〔(55.94±6.71)ng/ml〕明顯高于空白組大鼠〔(14.28±2.12)ng/ml〕，比空白組大鼠血清皮質(zhì)醇濃度高三倍以上，二者比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且與抑郁癥病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。而損毀韁核后，大鼠血清皮質(zhì)醇濃度〔(35.60±2.62)ng/ml〕明顯降低，雖然并未完全恢復(fù)至正常水平，但與假手術(shù)組〔(53.98±9.73)ng/ml〕相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而假手術(shù)組大鼠血清皮質(zhì)醇濃度與抑郁癥模型組大鼠血清皮質(zhì)醇濃度相比變化較小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

抑郁癥大鼠下丘腦室旁核內(nèi)CRH陽(yáng)性神經(jīng)元明顯高于空白組，且染色明顯加深。而且韁核損毀后，CRH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，陽(yáng)性著色也明顯變淺，但假手術(shù)組與抑郁癥模型組相比卻無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖1。

表1 韁核損毀對(duì)開(kāi)野實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中大鼠行為的影響± s，n=8)

表1 韁核損毀對(duì)開(kāi)野實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中大鼠行為的影響± s，n=8)

與空白組比較：1)P＜0.01

組別 開(kāi)野實(shí)驗(yàn)(5 min)水平運(yùn)動(dòng)次數(shù) 直立次數(shù)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(5 min)不動(dòng)時(shí)間(s) 上竄時(shí)間(s)空白組 69.40±20.64 28.59±7.49 51.59±15.67 98.03±14.4抑郁癥模型組 26.67±17.351) 12.94±7.311) 110.54±26.361) 27.94±9.691)抑郁癥+韁核損毀組 57.33±8.03 19.63±2.37 21.97±6.99 75.81±5.31抑郁癥+假手術(shù)組 26.50±2.831) 7.89±1.211) 154.33±20.161) 17.32±1.621)

圖1 韁核損毀對(duì)大鼠下丘腦室旁核CRH表達(dá)的影響(×400)

3 討論

隨著人們生活水平的提高及對(duì)高質(zhì)量生活的追求，生活節(jié)奏的加快，抑郁癥的患病率呈現(xiàn)了逐年上升的趨勢(shì)，而在人類自身探討抑郁癥發(fā)病及治療機(jī)制有很多的局限性，為此科研工作者在尋找與人類相似的抑郁癥動(dòng)物模型以探討和揭示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制。國(guó)內(nèi)外有許多實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)從事對(duì)慢性刺激大鼠模型的研究工作，經(jīng)過(guò)多年的實(shí)驗(yàn)國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為慢性刺激抑郁模型具有高度的有效性，雖然這一抑郁癥模型在過(guò)去因?yàn)檩^難重復(fù)而得不到公認(rèn)，但最近大量的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步確定，嚙齒類慢性刺激抑郁模型的行為改變與人類抑郁癥的行為改變完全一致〔5，6〕。

在經(jīng)過(guò)21 d的慢性溫和性刺激后大鼠在開(kāi)野實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)度較正常組大鼠明顯降低。這些結(jié)果與近來(lái)大量的人類抑郁癥研究結(jié)果一致。大量研究結(jié)果顯示，抑郁癥患者的血漿皮質(zhì)醇濃度分泌增加，失去了正常人夜間自發(fā)性分泌抑制的節(jié)律，整天處于腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)狀態(tài)〔3〕。Catalan等〔4〕發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者下丘腦及下丘腦外的CRH濃度都升高，與輕度或中度抑郁發(fā)作相比，重度抑郁組CRH濃度更高，且CRF與皮質(zhì)醇血濃度顯著相關(guān)，這些結(jié)果都證明了本文制備的抑郁癥大鼠模型是成功的。用此種模型來(lái)研究抑郁癥的發(fā)病及治療機(jī)制所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是可靠的、有效的。韁核損毀后，抑郁癥大鼠在開(kāi)野實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)度均較損毀前明顯增加，抑郁行為得到改善。損毀韁核后大鼠血清皮質(zhì)醇及CRH在下丘腦室旁核的表達(dá)也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，此結(jié)果與Sparks等〔7〕的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全相一致。因此推測(cè)在抑郁癥發(fā)病過(guò)程中，韁核神經(jīng)元活動(dòng)的增加促進(jìn)了下丘腦室旁核CRH神經(jīng)元的活動(dòng)，引起CRH表達(dá)增加，通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的調(diào)節(jié)作用引起腎上腺皮質(zhì)激素分泌及釋放增加，血清皮質(zhì)醇濃度升高。所以當(dāng)韁核被損毀后，韁核神經(jīng)元的作用完全消失，下丘腦室旁核CRH神經(jīng)元的活動(dòng)減弱，CRH表達(dá)降低，通過(guò)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的調(diào)控作用進(jìn)一步引起血清皮質(zhì)醇濃度下降，從而改善了抑郁癥大鼠的抑郁癥狀。這與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道完全一致，抑郁癥患者血清皮質(zhì)醇濃度高于正常人群，且與抑郁癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，隨著抑郁癥的好轉(zhuǎn)而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)〔4〕。這更進(jìn)一步證明了韁核在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的重要作用，為抑郁癥的發(fā)病機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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R749

A 〔

1005-9202(2012)23-5201-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.045

黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(No.1153G039)

1 吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室

趙 華(1957-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

楊利敏(1973-)，女，副教授，博士，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。

〔2012-03-15收稿 2012-06-25修回〕

(編輯 徐 杰)