王恩軍 靳 祎 季文琦 關(guān) 宏 肖 鋒 (河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 07000)

山茱萸水提取物對人肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用

王恩軍 靳 祎 季文琦1關(guān) 宏2肖 鋒 (河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

目的 探討山茱萸水提取物對人肺癌A549細(xì)胞的體外增殖的抑制及凋亡作用。方法 采用MTT法及DNA瓊脂糖凝膠電泳法檢測山茱萸水提取物對A549細(xì)胞增殖的抑制及凋亡作用，并觀察細(xì)胞形態(tài)改變。結(jié)果 山茱萸水提取物對A549細(xì)胞抑制作用較明顯，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的量效、時效關(guān)系;經(jīng)不同劑量的山茱萸水提取物處理的細(xì)胞電泳均出現(xiàn)相差約200 bp的DNA梯狀電泳圖譜，形態(tài)學(xué)觀察到細(xì)胞凋亡。結(jié)論 山茱萸水提取物對人肺癌A549的細(xì)胞增殖有較強的抑制作用，能誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。

山茱萸水提取物;肺癌;A549;抑制作用

山茱萸是山茱萸科落葉灌木或小喬木，其干燥成熟果實為中藥，別名山萸肉、蜀酸棗、藥棗、肉棗、薯棗、棗皮、雞足、天木籽、實棗兒等，其味酸、澀、微溫，歸肝、腎經(jīng)，有補益肝腎、澀精固脫之功效〔1，2〕，為我國常用的名貴中藥材?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實山茱萸果肉中含有生理活性較強的山茱萸甙、酒石酸、沒食子酸、蘋果酸、樹酯、糖類、鞣質(zhì)和維生素等多種有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗血小板聚集、抗菌等多種藥理作用。在抗癌研究方面，山茱萸對多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用〔3～5〕。本試驗采用人肺癌A549細(xì)胞作為試驗?zāi)Ｐ?，研究山茱萸水提取物體外抗肺癌活性，探討山茱萸的抗癌機制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

①山茱萸水提取物：由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，每1 g相當(dāng)于原生藥2 g，制成500 mg/ml的溶液，高壓滅菌4℃保存(原生藥從河北安國縣藥材公司購買);②人肺癌A549細(xì)胞：購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所，后經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院傳代凍存提供。

1.2 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液、乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶(GIBCO公司);順鉑(齊魯制藥有限公司);四甲基耦氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司);瓊脂糖(北京拜爾迪生物公司);200 bp DNA marker(華美生物工程有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實驗采用體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞系，經(jīng)0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化后吹打，1 500 r/min離心，稀釋至細(xì)胞濃度1×105個/ml。接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔200 μl?？瞻卓字患优囵B(yǎng)液不加細(xì)胞，每組設(shè)4個平行孔，置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h〔6〕。

1.3.2 藥物敏感性試驗 待細(xì)胞貼壁后，實驗組每孔加入不同劑量的山茱萸水提取物，分別為每孔 10，20，40，80 μl，使藥物終濃度分別為25、50、100、200 mg/ml。放入培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48 h和72 h。以終濃度為20 μg/ml的順鉑作為陽性對照，以生理鹽水作為陰性對照。

1.3.3 MTT法檢測山茱萸水提取物體外抗腫瘤活性 待藥物作用細(xì)胞規(guī)定時間后，取出培養(yǎng)板，每孔加入5 μg/μl的MTT液 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸掉培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 150 μl，震蕩15 min，于酶標(biāo)儀上在570 nm波長下測定各孔吸光度值(A值)，計算不同劑量的山茱萸水提取物對細(xì)胞增殖的抑制率(GIR)，所有試驗重復(fù)3次。增殖細(xì)胞抑制率(%)=(1-實驗組A值 /空白對照組A值)×100%。

1.3.4 形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，實驗組每孔加入20 μl的山茱萸水提取物，對照組加入生理鹽水，培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析 取對數(shù)生長期細(xì)胞5瓶，每瓶共含有1×106個細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液把山茱萸水提取物稀釋成不同濃度(終濃度為 0、25、50、100、200 mg/ml)，分別加入5個培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液至5 ml，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用PBS洗2次;加細(xì)胞裂解液，再加蛋白酶K，振搖使懸液混勻，50℃過夜;冷卻后加入等體積的飽和酚溶液，混合后離心，吸出上層水相，移至另一離心管中，重復(fù)抽提，直到無蛋白為止;吸上清加入氯仿/異戊醇(24∶1)再抽提一次，吸取水相層加入1/10體積的醋酸鈉溶液混勻，再加入冷無水乙醇，離心，收集沉淀，70%乙醇漂洗2次，晾干;加入TE緩沖液融解DNA，再加入RNA酶，置37℃作用30 min，取10 μl提取的各組DNA樣品液與上樣緩沖液按4∶1混勻后點樣，在2%瓊脂糖凝膠上電泳2 h，電壓為80 V，取凝膠到凝膠成像儀上拍照分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 組間比較行t檢驗。

胎牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所);

2 結(jié)果

2.1 山茱萸水提取物對A549細(xì)胞抑制作用的量效關(guān)系

A549細(xì)胞經(jīng)不同劑量的山茱萸水提取物處理48 h后，均顯示較明顯的細(xì)胞抑制作用，實驗組與對照組比較，A值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其抑制率隨濃度的降低有所下降，在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴關(guān)系(量效關(guān)系)。見表1。

2.2 山茱萸水提取物對A549細(xì)胞抑制作用的時效關(guān)系

4種不同劑量的山茱萸水提取物作用于A549細(xì)胞24、48、72 h，隨著作用時間的延長，抑制作用明顯增強(時效關(guān)系)。見表2。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察

對照組肺癌A549細(xì)胞生長良好，密度較大，部分重疊成簇，為長梭形或多角形，排列無方向，細(xì)胞邊緣清楚;A549細(xì)胞經(jīng)山茱萸水提取物處理后，細(xì)胞體積縮小，數(shù)量減少，逐漸變?yōu)閳A形，與周圍的細(xì)胞分離，培養(yǎng)液中可見許多漂浮的顆粒。

2.4 DNA凋亡帶的觀察

A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度山茱萸水提取物處理48 h后，除空白對照外的細(xì)胞，電泳檢測均可見DNA有規(guī)律的降解，形成了特征性的梯狀條帶(DNA ladder)，表明一定量的山茱萸水提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

表1 不同劑量的山茱萸水提取物對A549細(xì)胞增殖的抑制作用(n=4s)

表1 不同劑量的山茱萸水提取物對A549細(xì)胞增殖的抑制作用(n=4s)

與對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 劑量 吸光值 抑制率(%)陰性對照組- 0.370±0.002 -陽性對照組 20 μg/ml 0.042±0.0042) 88.47±0.23山茱萸水提物 25 mg/ml 0.193±0.0031) 47.76±0.18 50 mg/ml 0.184±0.0041) 50.24±0.36 100 mg/ml 0.173±0.0012) 53.00±0.33 200 mg/ml 0.132±0.0032)64.17±0.22

表2 山茱萸水提取物不同作用時間對A549細(xì)胞的抑制率(n=4 ± s，%)

表2 山茱萸水提取物不同作用時間對A549細(xì)胞的抑制率(n=4 ± s，%)

與前一時間點比較：1)P＜0.05

濃度(mg/ml)24 h 48 h 72 h 25 42.34±0.27 47.76±0.181) 50.00±0.411)50 50.01±0.24 50.24±0.361) 53.69±0.211)100 47.29±0.15 53.00±0.331) 59.27±0.321)200 58.44±0.15 64.17±0.221) 70.33±0.161)

3 討論

肺癌是目前全世界的頭號癌癥殺手，近年來其發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，均占癌癥首位〔7〕，每年因肺癌死亡的人數(shù)多于乳腺癌、腸癌和前列腺癌死亡人數(shù)的總和，臨床通常采取手術(shù)、放化療、免疫及中藥等多學(xué)科綜合治療。目前針對腫瘤生長的某些主要環(huán)節(jié)研制安全有效的抗腫瘤藥物是現(xiàn)在藥物開發(fā)的新的發(fā)展方向，隨著中醫(yī)對肺癌的認(rèn)識的深入，臨床療效不斷提高，中醫(yī)藥療法已成為治療中晚期肺癌的主要方法之一，人們在研究中已發(fā)現(xiàn)有些中藥不但能夠有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖，而且還可以抑制腫瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲〔8，9〕。

臨床藥理研究表明山茱萸具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗血小板聚集、抗休克、強心作用、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗艾滋病和治療不育癥等作用，目前報道較多的有其抗衰老、增強免疫的作用，而其他研究卻甚少。

本試驗山茱萸水提取物對A549細(xì)胞增殖有較強的抑制作用，抑制程度與山茱萸水提取物的濃度和作用時間有關(guān)，濃度越高、作用時間越長對A549細(xì)胞的抑制作用越好，量效關(guān)系和時效關(guān)系明顯。另外細(xì)胞毒性的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示山茱萸水提取物作用于細(xì)胞后，可看到細(xì)胞圓縮，由貼壁生長轉(zhuǎn)為逐漸脫落，細(xì)胞間出現(xiàn)明顯空隙，細(xì)胞凋亡的特征明顯。

染色體DNA的降解是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。在細(xì)胞凋亡的后期，半胱氨酸蛋白酶激活的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶切斷了核小體間的染色體DNA，雙鏈斷裂，由此產(chǎn)生了一系列大小為180至220堿基的DNA碎小片段，這些片段在凝膠電泳上通過染色呈現(xiàn)出“階梯”樣。經(jīng)山茱萸水提取物作用的A549細(xì)胞DNA提取有DNA Ladder凋亡條帶的出現(xiàn)，說明山茱萸水提取物能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，這為今后進(jìn)一步研究山茱萸的抗腫瘤作用機制提供了試驗依據(jù)。

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R734.2

A

1005-9202(2012)23-5184-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.038

保定市科技局科學(xué)研究與發(fā)展計劃項目(09ZF011);河北省人口與計劃生育委員會科研計劃項目(2009-B18)

1 河北大學(xué)醫(yī)學(xué)培訓(xùn)中心 2 保定市第一中心醫(yī)院急診科

王恩軍(1977-)，男，講師，碩士，主要從事抗腫瘤中藥及藥理研究。

〔2011-07-25收稿 2011-12-12修回〕

(編輯 曹夢園)