王 凡 任家謀 齊曉嵐 劉 健 官志忠

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室及附院病理科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

SH-SY5Y細(xì)胞α7尼古丁受體基因抑制對(duì)APP代謝的影響

王 凡1任家謀2齊曉嵐2劉 健1官志忠1

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室及附院病理科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的 采用RNA干擾技術(shù)抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞)中α7神經(jīng)型尼古丁乙酰膽堿受體(nAChR)基因表達(dá)，了解對(duì)β淀粉樣前體蛋白(APP)代謝中的γ-分泌酶兩個(gè)重要組分早老蛋白(PS)及單過(guò)性跨膜蛋白(NCT)水平的影響。方法 SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染針對(duì)α7 nAChR的小干擾RNA(siRNA)，用實(shí)時(shí)PCR法和Western印跡法分別測(cè)定細(xì)胞中α7 nAChR、PS及NCT在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后，與對(duì)照組相比，α7 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低;PS蛋白mRNA及蛋白水平均升高，而NCT水平無(wú)明顯變化。結(jié)論 α7 nAChR基因表達(dá)抑制后γ-分泌酶組分之一PS的水平明顯升高，這種改變可能與α7 nAChR基因表達(dá)抑制后β-淀粉樣蛋白(Aβ)的產(chǎn)生增多有關(guān)，可能與阿爾茨海默氏病(AD)的發(fā)病有一定的關(guān)系。

α7尼古丁乙酰膽堿受體;γ-分泌酶;早老蛋白;單過(guò)性跨膜蛋白

神經(jīng)型尼古丁乙酰膽堿受體(nAChR)在AD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，在APPSWE轉(zhuǎn)基因大鼠腦標(biāo)本中可見(jiàn)α7 nAChR的選擇性升高，提示α7 nAChR的升高是對(duì)Aβ毒性作用的一種保護(hù)機(jī)制。RNA干擾(RNAi)是通過(guò)具有一定結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的小干擾RNA(siRNA)，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，促使同源性mRNA分子特異性降解同時(shí)可抑制其翻譯，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的過(guò)程〔1〕。本研究用RNAi技術(shù)抑制SHSY5Y細(xì)胞α7 nAChR的表達(dá)，研究其受抑制后β淀粉樣前體蛋白(APP)代謝的關(guān)鍵酶γ-分泌酶兩個(gè)主要組成部分早老蛋白(PS)及單過(guò)性跨膜蛋白(NCT)表達(dá)水平的變化，從而探討α7 nAChR在AD發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

源于人腦的SH-SY5Y細(xì)胞由本課題組保存;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)于Hyclone公司;鼠抗人α7 nAChR單克隆抗體(sc-65865)，鼠抗人NCT單克隆抗體(sc-136003)，鼠抗人PS-1單克隆抗體(sc-365495)及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的驢抗鼠二抗(sc-2314)、α7 nAChR siRNA(sc-42532)、siRNA陰性對(duì)照(sc-37007)、siRNA熒光質(zhì)控(sc-36869)、siRNA轉(zhuǎn)染試劑(sc-29528)、siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(sc-36868)均購(gòu)于Santa Cruz公司;Oligo dT、dNTP購(gòu)于上海生工公司;Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于Promega公司;RNA酶抑制劑購(gòu)于Toyobo公司;Syber-green 2×PCR Mix購(gòu)于Roche公司;鼠抗人β-actin單克隆抗體(A-1987)購(gòu)于Sigma公司;聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus發(fā)光試劑、高效顯影膠片購(gòu)于Amersham公司;顯影液、定影液購(gòu)于柯達(dá)公司;細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天公司，普通化學(xué)試劑均購(gòu)于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM，添加15%胎牛血清、1%雙抗 (青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)培養(yǎng)箱中含5%CO2，溫度為37℃。細(xì)胞分組為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA即RNA干擾組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.2 siRNA的轉(zhuǎn)染 生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳入六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其匯合度達(dá)80%時(shí)按Santa Cruz公司轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)按不同比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染siRNA熒光質(zhì)控，根據(jù)熒光值摸索和優(yōu)化siRNA的轉(zhuǎn)染條件。再分別轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA、siRNA陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并設(shè)未轉(zhuǎn)染組作為空白對(duì)照，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)mRNA水平 采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行 Real-time PCR，采用 Syber green法測(cè)定。α7 nAChR、PS-1、NCT和內(nèi)對(duì)照 β-actin引物序列見(jiàn)表 1，ABI Step One plus型熒光定量PCR儀采集待測(cè)基因及內(nèi)對(duì)照β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)，以Applied Biosystems SDS1.4軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。SDS1.4軟件分析其△△Ct值及RQ值，RQ=2-△△Ct。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算各基因在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的相對(duì)水平。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段

1.2.4 蛋白表達(dá)水平的測(cè)定 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白并定量，用Western印跡方法檢測(cè)α7 nAChR、PS-1及NCT蛋白表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。以Labworks軟件分析結(jié)果時(shí)以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算α7 nAChR、PS-1及NCT蛋白條帶與β-actin蛋白條帶像素灰度的百分比值作為蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后SH-SY5Y細(xì)胞α7 nAChR mRNA(表2)水平和蛋白(表3，圖1)表達(dá)明顯降低，與對(duì)照組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照與對(duì)照組相比無(wú)差異。說(shuō)明已將α7 nAChR siRNA轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞，且抑制了α7 nAChR mRNA和蛋白水平的表達(dá)。

2.2 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后對(duì)γ-分泌酶主要組分PS-1及NCT mRNA及蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA后SHSY5Y細(xì)胞PS-1 mRNA及蛋白水平分別升高了87%和76%，與對(duì)照組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后SH-SY5Y細(xì)胞NCT mRNA及蛋白水平與對(duì)照組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組相比差異無(wú)高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說(shuō)明下調(diào)α7 nAChR水平能使γ-分泌酶的主要組分PS-1表達(dá)水平升高，從而增加γ-分泌酶對(duì)APP的切割。見(jiàn)表2，表3，圖2。

表2 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR，PS-1及NCT mRNA表達(dá)s，n=9)

表2 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR，PS-1及NCT mRNA表達(dá)s，n=9)

與對(duì)照組比較：1)P＜0.01，下表同

組別 β-actin Ct值 目的基因Ct值 2-△△ct α7 nAChR 對(duì)照組22.128±0.30 27.286±0.39 1.00陰性對(duì)照組 21.224±0.34 27.458±0.41 0.95 α7 siRNA組 21.093±0.27 29.146±0.53 0.271)PS-1 對(duì)照組 22.128±0.30 21.928±0.27 1.00陰性對(duì)照組 21.224±0.34 22.051±0.41 0.98 a7 siRNA組 21.093±0.27 20.986±0.24 1.871)NCT 對(duì)照組 22.128±0.30 19.65±0.23 1.00陰性對(duì)照 21.224±0.34 19.82±0.27 0.95 α7 siRNA組21.093±0.27 19.66±0.30 0.97

表3 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后a7 nAChR，PS-1及NCT蛋白表達(dá)(s，n=9，%)

表3 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后a7 nAChR，PS-1及NCT蛋白表達(dá)(s，n=9，%)

蛋白名稱(chēng) 對(duì)照組 陰性對(duì)照組 RNA 干擾組α7 nAChR 100.0 99.7±7.81 9.3±0.61)PS-1 100.0 97.8±4.0 182.3±7.11)NCT 100.0 98.2±5.29 7.4±4.5

圖1 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后α7 nAChR蛋白表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA后PS-1及NCT蛋白表達(dá)

3 討論

RNAi能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(PTGS)特異性抑制基因表達(dá)〔1〕。目前RNAi技術(shù)已廣泛用于功能基因組學(xué)、基因治療學(xué)、新的藥物開(kāi)發(fā)等眾多領(lǐng)域〔2〕。

nAChR與大腦學(xué)習(xí)記憶、智力發(fā)育和識(shí)別能力等腦功能有關(guān)，還調(diào)節(jié)多種受體的功能，并具有對(duì)抗細(xì)胞毒素性神經(jīng)保護(hù)作用，其減少與AD的發(fā)生有關(guān)。大量研究報(bào)道AD病人腦中，膽堿能系統(tǒng)嚴(yán)重受損，與對(duì)照組相比，AD病人腦中高親和力尼古丁受體明顯下降〔3〕。研究證實(shí)，nAChR與認(rèn)知功能呈顯著的正相關(guān)，在疾病發(fā)生的早期即出現(xiàn)特異性的nAChR減少〔4〕。α7 nAChR作為nAChR中重要的成員，其在APPSWE轉(zhuǎn)基因大鼠腦標(biāo)本中選擇性升高，提示α7 nAChR的升高是對(duì)Aβ毒性作用的一種保護(hù)機(jī)制，在調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性方面具有獨(dú)特的作用〔5〕。在APPSWE轉(zhuǎn)基因大鼠腦標(biāo)本中可見(jiàn)α7 nAChR的選擇性升高，也提示α7 nAChR的升高是對(duì)Aβ毒性作用的一種保護(hù)機(jī)制。本研究將針對(duì)α7 nAChR的siRNA片段轉(zhuǎn)染到SHSY5Y細(xì)胞中，mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降了。表明α7 nAChR siRNA能有效地抑制內(nèi)源性α7 nAChR的表達(dá)。PS是γ-分泌酶的核心部分，是γ-分泌酶活性所必需的，有研究發(fā)現(xiàn)PS的異二聚體和NCT都特異性地結(jié)合γ-分泌酶抑制劑并且和γ-分泌酶活性有關(guān)，表明NCT也是影響γ-分泌酶的活性因素。抑制NCT表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致減少PS的CTF形成和APH-1和PEN-2的表達(dá)，增加APP的C端片段，減少Aβ的生成。

我們前期的研究表明，通過(guò)RNAi方法選擇性下調(diào)SHSY5Y細(xì)胞中α7 nAChR的表達(dá)能使細(xì)胞Aβ生成增多，這可能與受體表達(dá)抑制后β-分泌酶BACE1的表達(dá)增加，增加βAPPs的生成有關(guān)。此次我們針對(duì)APP代謝中另一種重要的酶γ-分泌酶的重要組分進(jìn)行了研究。α7 nAChR基因表達(dá)抑制能明顯增加γ-分泌酶組分PS-1mRNA及蛋白水平的表達(dá)，γ-分泌酶水平的增加也進(jìn)一步增加了Aβ的產(chǎn)生與蓄積，這可能是AD發(fā)病中Aβ生成增多的機(jī)制，另一重要組分NCT的水平未見(jiàn)變化的原因尚需要進(jìn)一步的研究，這些結(jié)果均提示α7 nAChR對(duì)AD可能具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

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Influence of inhibiting α7 nicotinic acetylcholine receptor gene expression on the metabolism of APP in SH-SY5Y cells

WANG Fan，REN Jia-Mou，QI Xiao-Lan，et al.
Molecular Biology Laboratory of Guiyang Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China

Objective To investigate the influence of inhibiting α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor(nAChR)by small interference RNA(siRNA)on the level of presenilin(PS)and nicastrin(NCT)，the two components of γ-secretase in SH-SY5Y cells.Methods The siRNA of α7 nAChR was transfected into SH-SY5Y cells，and the expressions of α7 nAChR，PS and NCT mRNA and protein were detected by real-time PCR and Western blotting respectively.Results Compared with controls，the mRNA and protein levels of α7 nAChR in the SH-SY5Y cells transfected with the α7 nAChR siRNA were significantly decreased.Expressions of PS mRNA and protein levels were increased，while there was no difference in NCT level.Conclusions The inhibited α7 nAChR mRNA induced by siRNA may obviously increase the level of PS，the main component of γ-secretase，which may connect to the increased production of Aβ induced by the inhibiting of α7 nAChR，and might be connected with the pathogenesis of AD.

α7 nAChR; γ-secretase;Presenilin(PS);Nicastrin(NCT)

R749.1

A

1005-9202(2012)23-5177-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.035

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30960123);貴州省科技廳基金項(xiàng)目黔科合J字2012〔2056〕

1 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

2 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

官志忠(1951-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事老年性癡呆發(fā)病機(jī)制研究。

王 凡(1975-)，男，在讀博士，主要從事神經(jīng)分子生物學(xué)研究。

〔2012-07-12收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)