郝振軍 王志學 孫立新 閆彩云 李汝泓 雷 燕 (承德市婦幼保健院麻醉科，河北 承德 067000)

不同濃度嗎啡對5-氟尿嘧啶誘導的MCF-7乳腺癌細胞凋亡時Bcl-2、Bax表達的影響

郝振軍 王志學1孫立新2閆彩云1李汝泓1雷 燕3(承德市婦幼保健院麻醉科，河北 承德 067000)

目的 研究嗎啡與5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯(lián)合應用對MCF-7乳腺癌細胞Bcl-2、Bax表達的影響。方法 藥物作用48 h后通過免疫細胞化學技術檢測Bcl-2、Bax表達情況。結果 Bcl-2表達情況：未處理組最強。單獨應用嗎啡處理時，濃度為250、1 250 μmol/L引起B(yǎng)cl-2表達減弱(P＜0.05，P＜0.01)，三種濃度的嗎啡與5-Fu聯(lián)合應用均具有協(xié)同作用(P＜0.05)。Bax表達情況：未處理組最弱。單獨應用嗎啡處理時，250、1 250 μmol/L濃度的嗎啡引起B(yǎng)ax表達增強(P＜0.05，P＜0.01)，三種濃度的嗎啡與5-Fu聯(lián)合應用，均具有協(xié)同作用(P＜0.05)。結論 一定濃度的嗎啡能與5-Fu發(fā)揮協(xié)同作用，強化5-Fu誘導的Bcl-2表達下調、Bax表達上調，且與嗎啡的濃度有一定的劑量依賴關系。

嗎啡;5-氟尿嘧啶;MCF-7;Bcl-2;Bax

長期以來阿片類藥物廣泛應用于癌痛治療，嗎啡的抑癌作用得以證實〔1〕，這無疑為阿片類藥物用于癌癥病人的疼痛治療增加了信心。但由于癌癥病人的疼痛治療往往不是單獨藥物實施，常與癌癥病人的化療同時進行，嗎啡與化療藥物聯(lián)合應用對抗癌效果有何影響值得關注。Bcl-2家族是凋亡研究中最受重視的癌基因之一，Bcl-2/Bax比值對決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)有重要意義〔2〕。本研究擬探討嗎啡與5-氟尿嘧啶 (5-Fu)聯(lián)合應用對乳腺癌細胞株MCF-7細胞Bcl-2、Bax表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MCF-7細胞，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;嗎啡注射液，東北制藥集團公司;5-Fu注射液，上海旭東海普藥業(yè)有限公司;胎牛血清，天津血液學研究所;RPMI1640培養(yǎng)基，Gibcobrl公司;鼠抗人Bcl-2、Bax免疫組化單克隆抗體，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設備

YT-CJ-1N超凈工作臺，北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心;CO2電熱恒溫培養(yǎng)箱，日本SANYO公司;HWSY21-K4C電熱恒溫水浴箱，北京市長風儀器儀表公司;QL-901振蕩器，中國其林貝爾;光學顯微鏡、倒置顯微鏡，日本Olympus;熒光倒置顯微鏡、數(shù)碼攝像系統(tǒng)、顯微采圖系統(tǒng)，日本尼康;Mivnt顯微圖像分析系統(tǒng)，珠海微宇科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組 共分8組，用含不同藥物的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。U組為非藥物處理組，F(xiàn)組為500 μmol/L 5-Fu處理組，LM組為50 μmol/L嗎啡處理組，MM組為250 μmol/L嗎啡處理組，HM組為1 250 μmol/L嗎啡處理組，LM+F組為50 μmol/L嗎啡與500 μmol/L 5-Fu聯(lián)合處理組，MM+F組為250 μmol/L嗎啡與500 μmol/L 5-Fu聯(lián)合處理組，HM+F組為1 250 μmol/L嗎啡與500 μmol/L 5-Fu聯(lián)合處理組。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 細胞復蘇成功后，調整濃度為1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶，靜置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱內，用RPMI1640完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，隔日換液。待貼壁70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3.3 細胞免疫化學檢測Bcl-2、Bax表達 將對數(shù)生長期的MCF-7細胞，制備成單細胞懸液，準確計數(shù)，調整細胞濃度約4×105/ml，接種在預先置于培養(yǎng)皿中的1 cm×1 cm蓋玻片上，每片接種0.5 ml。細胞貼壁后，分別向培養(yǎng)皿中加入預先配置好的含不同藥物的培養(yǎng)液，孵育48 h。丙酮固定、風干，磷酸鹽緩沖液 (PBS)沖洗，過氧化氫孵育，PBS再沖洗，血清封閉。加一抗，4℃過夜，PBS沖洗。加二抗，室溫下15～20 min，PBS沖洗。加二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)溶液，顯微鏡下觀察3～5 min。蘇木素復染，返藍，經梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。各組細胞藥物作用48 h，染色后的載玻片用Nikon Eclipse 50i顯微采圖系統(tǒng)對Bcl-2、Bax免疫陽性物進行采圖，MiVnt顯微圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。每組測量5張片，每張片于200倍鏡下隨機選取5個不同視野成像，測其平均灰度，取其平均值代表一張片上的陽性細胞平均灰度 (AGL)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 免疫細胞化學染色檢測Bcl-2蛋白表達情況

正常對照組可見絕大多數(shù)細胞質棕黃色染色，AGL最小、Bcl-2表達最強。單獨應用嗎啡處理時，隨著嗎啡濃度的增加，胞質棕黃色染色依次減弱、AGL依次增加;250、1 250 μmol/L濃度的嗎啡引起MCF-7細胞Bcl-2表達減弱 (P＜0.05，P＜0.01)，但嗎啡與Bcl-2表達的劑量依賴關系不明顯。單獨應用500 μmol/L 5-Fu處理時，胞質棕黃色染色減弱、AGL增加(P＜0.01)，引起MCF-7細胞Bcl-2表達減弱。與500 μmol/L 5-Fu聯(lián)合應用，隨著聯(lián)合用藥中嗎啡濃度增加，胞質棕黃色染色依次減弱，AGL依次增加;三組嗎啡與5-Fu聯(lián)合應用均具有協(xié)同作用 (P＜0.05)，比單獨應用500 μmol/L 5-Fu或該濃度嗎啡更能引起MCF-7細胞Bcl-2表達減弱，但聯(lián)合用藥中嗎啡與Bcl-2表達的劑量依賴關系不明顯。見表1，圖1。

2.2 免疫細胞化學染色檢測Bax蛋白表達情況

見表1，圖2。正常對照組可見絕大多數(shù)細胞質棕黃色染色不明顯，AGL最大、Bax表達最弱。單獨應用不同濃度的嗎啡處理時，隨著嗎啡濃度的增加，胞質棕黃色染色依次增強，AGL依次降低;250、1 250 μmol/L濃度的嗎啡引起MCF-7細胞Bax表達增強(P＜0.01)，且嗎啡與Bax表達存在劑量依賴關系。單獨應用500 μmol/L 5-Fu處理時，胞質棕黃色染色增強，AGL降低，引起MCF-7細胞 Bax表達增強 (P＜0.05)。與500 μmol/L 5-Fu聯(lián)合應用，隨著聯(lián)合用藥中嗎啡濃度增加，胞質棕黃色染色依次增強，AGL依次降低;三組嗎啡與5-Fu聯(lián)合應用，均具有協(xié)同作用 (P＜0.05)，比單獨應用500 μmol/L 5-Fu或該濃度嗎啡更能引起MCF-7細胞Bax表達增強，但聯(lián)合用藥中嗎啡與Bax表達的劑量依賴關系不明顯。

圖1 免疫細胞化學檢測不同藥物處理48 h各組MCF-7胞質內Bcl-2蛋白表達(×200)

圖2 免疫細胞化學檢測不同藥物處理48 h各組MCF-7胞質內Bax蛋白表達(×200)

表1 免疫細胞化學檢測不同藥物處理48 h各組的Bcl-2、Bax蛋白表達± s，n=5)

表1 免疫細胞化學檢測不同藥物處理48 h各組的Bcl-2、Bax蛋白表達± s，n=5)

與U 組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01;與LM 組比較：3)P＜0.01;與 MM組比較：4)P＜0.01;與HM組比較：5)P＜0.01;與F組比較：6)P＜0.05

組別Bcl-2 AGL Bax AGL U組158.183±8.96 212.78±11.48 LM組 160.490±7.786 207.67±7.80 MM組 170.191±8.6131) 189.31±7.952)HM組 188.176±12.6052) 173.76±10.692)LM+F組 197.827±8.6012)3)6) 150.24±11.892)3)6)MM+F組 207.779±8.8812)4)6) 141.75±8.762)4)6)HM+F組 226.635±5.6762)5)6) 127.81±10.732)5)6)F組 178.491±9.4932) 176.78±7.882)

3 討論

Bcl-2家族是凋亡研究中最受重視的癌基因之一，由抗凋亡基因和促凋亡基因組成，Bcl-2家族對細胞凋亡的調控取決于各成員間的相互作用。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族中最重要的兩個成員，它們影響著線粒體膜的通透性。Bcl-2位于線粒體的內膜，可以穩(wěn)定線粒體，通過抑制PT孔開放，保護線粒體完整性，從而抑制其內凋亡誘導因子Cyt C的釋放〔3〕。Bcl-2亦可防止一些與凋亡有關的基因被激活或抑制這些基因表達產物的功能〔4〕。腫瘤細胞在Bcl-2的庇護下，可以逃避免疫系統(tǒng)的識別無限制生長，而且Bcl-2的高表達還給癌細胞提供了足夠長時間來進行突變以增加復制和擴散能力，從而推動腫瘤細胞進一步發(fā)展。目前發(fā)現(xiàn)許多人類腫瘤均與Bcl-2的高表達有關，Alsabech等〔5〕檢測了在371例乳腺癌中Bcl-2的表達情況，有高達79.3%的陽性率，而且染色普遍很強。Bax是Bcl-2家族中研究最廣泛的促凋亡蛋白，位于胞質，氧化應激反應時轉位到線粒體外膜，影響線粒體通透性并且誘導Cyt C釋放到胞質中〔3〕。Bax可自身形成同源二聚體或與Bcl-2形成異源二聚體，當細胞中Bcl-2較多時，Bcl-2/Bax異源二聚體增加，凋亡趨勢減弱;當細胞中Bax較多時，Bax自身形成的同源二聚體占主導，則趨于凋亡。因此目前認為，Bcl-2的凋亡抑制作用能被Bax拮抗，Bcl-2/Bax比值對于細胞是否進入凋亡狀態(tài)有重要的決定性意義〔2〕。嗎啡作為疼痛治療的一線藥，同時有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。Singhal等〔6〕發(fā)現(xiàn)，嗎啡對巨噬細胞的促凋亡是通過轉移生長因子-β(TGF-β)的產生進而增加凋亡蛋白Bax而實現(xiàn)的。5-Fu可能通過上調Bax表達并改變Bax/Bcl-2比值而誘導凋亡，也早已被廣泛證實。

本研究結果顯示，5-Fu與嗎啡聯(lián)合應用在誘導腫瘤細胞凋亡過程中Bcl-2表達下調、Bax表達上調、Bcl-2/Bax比值降低更加顯著，說明兩藥聯(lián)合應用在線粒體途徑促進細胞凋亡過程中能發(fā)揮協(xié)同作用，顯著降低了MCF-7細胞對凋亡的抵抗性，提高了對凋亡誘導因素的敏感性〔7〕。

1 Tegeder I，Grosch S，Schmidtko A，et al.Protein-independent G1 cell cycle block and apoptosis with morphine in adenocarcinoma cells：involvement of p53 Phosphorylation〔J〕.Cancer Res，2003;63(8)：1846-52.

2 Simone F，Debatin KM.Apoptosis in drug response〔J〕.Curr Pharm，2003;1(1)：9-16.

3 Guo B，Zhai D，Cabezas E，et al.Humanin peptide suppresses apoptosis by interfering with Bax activation〔J〕.Nature，2003;423(6938)：456-61.

4 Oltvai Z，Milliman CL，Korsmever SJ，et al.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog，Bax，that accelerates programmed cell death〔J〕.Cell，1993;74(4)：609-12.

5 Alsabech R，Wilson CS，Ahn CW，et al.Expression of bcl-2 by breast cancer：a possible diagnostic application〔J〕.Mod Pathol，1996;9(4)：439-44.

6 Singhal PC，Kapasi AA，F(xiàn)ranki N，et al.Morphine-induced macrophage apoptosis：the role of transforming growth factor-β〔J〕.Immunology，2000;100(1)：57-62.

7 Ashkenazi A，Dixit VM，Death receptors：signaling and modulation〔J〕.Science，1998;281(5381)：1305-7.

Effects of different concentrations of morphine on Bcl-2 and Bax expressions in the process of MCF-7 cellular apoptosis induced by 5-Fluorouracil

HAO Zhen-Jun，WANG Zhi-Xue，SUN Li-Xin，et al.
Department of Anesthesiology，Chengde Maternal and Child Health Hospital，Chengde 067000，Hebei，China

Objective To study on the effects of different concentrations of morphine on Bcl-2 and Bax expressions in the process of MCF-7 cellular apoptosis induced by 5-Fluorouracil.Methods After treated for 48 h，the expressions of Bcl-2 and Bax were detected by immunocytochemistry.Results The expression of Bcl-2 of untreated group was the strongest.Using 500 μmol/L 5-FU only，the expression of Bcl-2 was decreased(P ＜0.01).Using morphine only，250 and 1 250 μmol/L of morphine leaded to decreasing the expression of Bcl-2(P＜0.05，P＜0.01).Using morphine combined with 5-FU，the synergisms of morphine with 5-FU were found in all three groups(P ＜0.05).The expression of Bax in untreated group was the weakest.Using 500 μmol/L 5-FU only，the expression of Bax was increased(P ＜0.01).Using morphine only，250 and 1 250 μmol/L of morphine leaded to increasing the expression of Bax(P ＜0.05，P ＜0.01).Using morphine combined with 5-FU，the synergisms were found in all three groups(P＜0.05).Conclusions Morphine in certain concentration could enhance significantly the down-regulating effect on Bcl-2 expression and up-regulating effect on Bax expression that are induced in MCF-7 breast cancer cells，in certain dose dependent manner.Combination of morphine and 5-FU could show synergisms

Morphine;5-fluorouracil;MCF-7;Bcl-2;Bax

R73-36;R34

A

1005-9202(2012)23-5164-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.030

承德市科學技術研究與發(fā)展計劃項目(No.201121037)

1 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科

2 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室

3 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院手術室

王志學(1978-)，男，醫(yī)學碩士，講師，主治醫(yī)師，主要從事癌痛治療對腫瘤生物學行為影響方面的研究。

郝振軍(1969-)，男，主治醫(yī)師，主要從事麻醉藥理學方面的研究。

〔2012-02-08收稿 2012-08-26修回〕

(編輯 袁左鳴)