張 適 俞愛萍 張 悅 李志超 (北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 0)

氯化三乙基錫抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及機制

張 適 俞愛萍1張 悅2李志超3(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

目的 探討氯化三乙基錫(TETC)對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖抑制作用的機制。方法 采用MTT法、熒光原位末端標(biāo)記方法和Western印跡方法，分別檢測不用濃度TETC作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率和Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 TETC對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制增殖作用，增殖抑制率呈劑量依賴性;TETC可誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性上升;TETC可下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax蛋白表達(dá)水平。結(jié)論 TETC可抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外增殖并誘導(dǎo)其凋亡，機制可能與其下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

氯化三乙基錫;膠質(zhì)瘤;Bcl-2;Bax

化療是治療腦膠質(zhì)瘤的重要手段之一，尋找有效的抗膠質(zhì)瘤藥物并探討其作用機制、尋找作用靶點尤顯重要。氯化三乙基錫(TETC)是脂溶性中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒物，能通過血腦屏障，腦組織是其靶器官，TETC能否成為抗腦膠質(zhì)瘤藥物目前國內(nèi)外未見報道。本實驗旨在研究TETC對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

TETC(Alfar Aesar美國)，四甲基耦氮唑鹽(MTT，Sigma)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma)，IMDM 細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清 (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)，ApoAlertTMDNA Fragmentation檢測試劑盒(BDbioscience)，Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體、Bax兔抗鼠多克隆抗體，均購于美國Santa Cruz公司。蛋白免疫印跡設(shè)備購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(購自上海細(xì)胞所)，為貼壁細(xì)胞。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在含有10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用0.25%胰酶(PBS配)消化傳代，傳代濃度為5×105/ml，傳至3代后細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測TETC對C6細(xì)胞的增殖抑制率 以每孔1×104個細(xì)胞將C6細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后12 h培養(yǎng)液棄去，加入含不同終濃度TETC并含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液，TETC終濃度分為0(生理鹽水對照組)、0.5、1.0、2.0 μmol/L(實驗組)，對照組設(shè)在第一孔，每一濃度設(shè)4個平行孔，每孔100 μl培養(yǎng)液。加藥后送回培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩后用酶標(biāo)儀(Bio-Rad Model 550美國)570 nm測定吸光度值(A值)，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.3 熒光原位末端標(biāo)記檢測TETC誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡率

按每孔5×105個細(xì)胞將C6細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含TETC終濃度分別為0 μmol/L(生理鹽水對照組)，0.5、1.0、2.0 μmol/L TETC(實驗組)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，按ApoAlertTMDNA Fragmentation檢測試劑盒步驟進行實驗。判定結(jié)果：激光共聚焦顯微鏡下觀察，計數(shù)凋亡細(xì)胞。在＞620 nm激發(fā)光下，所有細(xì)胞質(zhì)顯示強紅色熒光;在520 nm激發(fā)光下，凋亡細(xì)胞顯示強綠色熒光，在520 nm及620 nm激發(fā)光下顯示強黃色熒光。顯微鏡下檢測并在同一放大倍數(shù)下計數(shù)，計數(shù)10個不同視野的細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western印跡檢測C6細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá) 取對數(shù)生長期C6細(xì)胞，以5×105/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后換液，加入含TETC終濃度分別為0 μmol/L(生理鹽水對照組)，0.5、1.0、2.0 μmol/L(實驗組)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，分別收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞，提取蛋白，分光光度計檢測濃度，加入上樣緩沖液調(diào)至相同濃度，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別加入Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體和Bax兔抗鼠多克隆抗體，然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔 IgG，增強化學(xué)發(fā)光法(ECL，Amersham)檢測，圖像定量分析軟件(ImageQuant5.2 software，Amersham)分析蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TETC對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率

結(jié)果顯示，TETC能抑制C6細(xì)胞生長，降低其生存率，有明顯的劑量依賴性。0.5 μmol/L實驗組細(xì)胞的A值和抑制率與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，隨著藥物濃度的增加，1.0和2.0 μmol/L實驗組細(xì)胞增殖抑制率逐漸提高(P＜0.01)，各實驗組間差異顯著(P＜0.01)。見表1。

2.2 Western印跡檢測結(jié)果

不同濃度TETC作用C6細(xì)胞48 h后，隨著TETC濃度的增加，C6細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，而Bax蛋白表達(dá)逐漸增高。見圖1。

表1 不同濃度TETC作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h增殖抑制率的變化(n=4±s，η/%)

表1 不同濃度TETC作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h增殖抑制率的變化(n=4±s，η/%)

與對照組比較：1)P ＜0.05;與0.5 μmol/L TETC 比較：2)P ＜0.01;與1.0 μmol/L TETC 比較：3)P ＜0.01

組別 TETC濃度(μmol/L) A值 增殖抑制率對照組01.175±0.004 0實驗組 0.5 0.991±0.0051) 15.62±0.451)1.0 0.750±0.0031)2) 36.16±0.251)2)2.0 0.682±0.0041)2)3) 41.92±0.371)2)3)

圖1 Western印跡檢測蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 不同濃度TETC誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡率

熒光原位末端標(biāo)記檢測0.5、1.0和2.0 μmol/L TETC作用于 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h，均能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為(8.73±2.03)%、(24.18±2.57)%、(30.67±1.58)%。0.5、1.0、2.0 μmol/L TETC組與對照組凋亡率〔(4.83±0.65)%〕相比有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)，各劑量組間相比均有顯著性差異(P＜0.01)，細(xì)胞凋亡率隨著TETC劑量的增加而升高，存在著劑量依賴性。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是人類常見的惡性腫瘤之一，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，病死率較高〔1〕。有報道指出腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的45%，其平均生存時間大多不超過1年，如何提高腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療效果，是擺在面前的艱巨任務(wù)〔2〕。局部浸潤性生長是神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的一個重要特征，單純手術(shù)無法將腫瘤完全切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)〔3〕。術(shù)后化療原則上用于惡性膠質(zhì)瘤，但受制于血腦屏障等因素，影響了膠質(zhì)瘤化療的效果，常用的卡莫司汀、替洛莫司汀、尼泊苷等有效率均在30%以下〔4〕。因此尋找有效化療藥物，探討作用機制并尋找作用靶點是抗腦膠質(zhì)瘤研究的當(dāng)務(wù)之急。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在各種死亡信號刺激后發(fā)生的主動性死亡過程，受多種基因調(diào)控。在腫瘤細(xì)胞凋亡機制研究中，半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)家族和Bcl-2家族最為引人關(guān)注。Caspase級聯(lián)反應(yīng)在凋亡通路中處于重要地位，其中Caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)Caspase成員中引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性激酶，也是細(xì)胞凋亡的主要參與成分〔6〕。Bcl-2是一種原癌基因，Bcl-2蛋白對不同因素引起的細(xì)胞凋亡均有抑制作用，在各種正常細(xì)胞的發(fā)育過程中表達(dá)，而在成熟或走向凋亡的細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)〔7〕。Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞膜多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，能夠在細(xì)胞膜上形成選擇性離子通道，還可能影響細(xì)胞色素C等重要蛋白通過，進而調(diào)控Caspase-3的活化和細(xì)胞凋亡〔8〕。Bcl-2家族蛋白調(diào)控凋亡的機制可能是由細(xì)胞色素C和dATP引發(fā)Caspase-9激活而引起的。Bcl-2家族中Bax、Blk和Bak等促凋亡蛋白能促進細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。胞質(zhì)中凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)在細(xì)胞色素C和dATP存在條件下可與Caspase-9結(jié)合并激活它。激活的Caspase-9繼而切斷并活化Caspase-3、-7等下游蛋白酶級聯(lián)，最終引起凋亡。Bcl-2和Bcl-XL等抗凋亡蛋白可通過與Bax等促凋亡蛋白形成異二聚體阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放，或直接與Apaf-1、Caspase-9結(jié)合成三元復(fù)合物，從而阻止Caspase-9途徑的激活〔9〕。有研究表明促凋亡蛋白Bax在鋁致神經(jīng)細(xì)胞凋亡與多種神經(jīng)退行性疾病致病機制中起關(guān)鍵作用，降低其活性能明顯減緩神經(jīng)退行性疾病病理進程〔10〕。因此通常認(rèn)為抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)情況是細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，它們作用在Caspase-3的上游，最終通過抑制和促進Caspase-3激活而發(fā)揮抗凋亡和促凋亡作用。本實驗結(jié)果表明，增加TETC的藥物濃度后Bcl-2表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)逐漸增強，TETC通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)和相應(yīng)上調(diào)Bax表達(dá)而誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡。

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Inhibitory effect and mechanism of triethyltin chloride on proliferation in C6 glioma cells

ZHANG Shi，YU Ai-Ping，ZHANG Yue，et al.
Department of Pathology，Medical College of Beihua University，Jilin 132013，Jilin，China

Objective To study the inhibition mechanism of triethyltin chloride(TETC)on proliferation of C6 glioma cells in vitro.Methods Inhibitory rate of TETC on the proliferation of C6 glioma cells，apoptotic rate of C6 glioma cells and expression of Bcl-2 and Bax protein were tested by MTT assay，fluorescent TUNEL assay and Western blotting analysis at 48 h after treated by different concentrations of TETC on C6 glioma cells，respectively.Results The proliferation of C6 glioma cells was inhibited by TETC in a dose-dependent manner.TETC induced apoptosis of C6 glioma cells and the apoptotic rate was increased in a dose-dependent manner.The expressions of Bcl-2 and Bax protein were down-regulated and up-regulated，respectively.Conclusions TETC could inhibit the proliferation of C6 glioma cells in vitro.TETC could induce the apoptosis of C6 glioma cells，decrease the expression of Bcl-2 protein，increase the expression of Bax protein，lead to apoptosis of C6 glioma cells，and these maybe the mechanism of anti-proliferation of TETC.

Triethyltin chloride;Glioma;Bcl-2;Bax

R730.264

A

1005-9202(2012)23-5154-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.026

國家自然科學(xué)基金資助(No.30070645)

1 北華大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 2 廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心

3 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

張 適(1970-)，男，副教授，博士，主要從事重金屬生物學(xué)效應(yīng)及腫瘤病理研究。

〔2012-03-27收稿 2012-09-30修回〕

(編輯 袁左鳴)