葉 華 郭 蒙 吳 瓊 朱宇珍 鄭學(xué)寶

(廣東醫(yī)學(xué)院廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023)

半枝蓮多糖對(duì)C26荷瘤小鼠caspase-3，8，9活性的影響

葉 華 郭 蒙1吳 瓊1朱宇珍 鄭學(xué)寶

(廣東醫(yī)學(xué)院廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023)

目的 觀察半枝蓮多糖(SPS)對(duì)C26荷瘤小鼠caspase-3，8，9活性的影響。方法 通過(guò)腋下接種C26結(jié)腸癌細(xì)胞建立小鼠移植瘤模型，SPS作用10 d后，根據(jù)腫瘤重量計(jì)算抑瘤率評(píng)價(jià)SPS對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，分光光度法檢測(cè)腫瘤組織中caspase-3，8，9活性。結(jié)果 與模型組比較，SPS可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，提高腫瘤組織中caspase-3和caspase-9的活性，而caspase-8活性沒(méi)有明顯改變。結(jié)論 SPS可能通過(guò)活化caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

半枝蓮多糖;半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶;凋亡;腫瘤

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，以40～50歲年齡組發(fā)病率最高，全球每年新發(fā)病例約800萬(wàn)人，占所有惡性腫瘤的10%～15%。結(jié)腸癌在我國(guó)的發(fā)病率有增高的趨勢(shì)，死亡率僅次于肺癌和肝癌，占我國(guó)惡性腫瘤第三位。近年來(lái)，隨著西妥昔和貝伐單抗等新型靶向藥物的臨床應(yīng)用，患者的生存率有了提高〔1，2〕，但僅限于 KRAS 為野生型的腫瘤〔3〕。天然產(chǎn)物是新藥研發(fā)中的重要領(lǐng)域，半枝蓮多糖是從半枝蓮中提取的有效成分之一，研究顯示可抑制 S180、H22荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)〔4，5〕。本文通過(guò)建立小鼠結(jié)腸癌模型，觀察半枝蓮多糖(SPS)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的影響，探討半枝蓮多糖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;C26結(jié)腸癌細(xì)胞，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥理教研室惠贈(zèng);半枝蓮多糖，本室自制;5氟尿嘧啶(5-FU)，上海

BALB/C小鼠，18～22 g，雌雄各半，廣東醫(yī)學(xué)旭東海普藥業(yè)有限公司;RPMI-1640，美國(guó)GIBCO公司;caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BALB/C鼠源性結(jié)腸癌細(xì)胞系C26，用含10%胎牛血清1 640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C26結(jié)腸癌細(xì)胞，用生理鹽水稀釋成含量為1×107/ml的細(xì)胞懸液。小鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2 ml細(xì)胞懸液，10 d后將生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織剪切成1 mm3左右，在無(wú)菌條件下，接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，如此傳3代后，大批接種小鼠腋下，制備實(shí)體瘤模型。

1.2.3 分組及給藥 將接種C26細(xì)胞24 h后的小鼠隨機(jī)分為5組，每組各10只。模型組，每天灌胃給予NS 0.1 ml/10 g;5-FU 組，腹腔注射給予5-FU 15 mg·kg-1·d-1，SPS 低、中、高劑量組分別灌胃給予 SPS 50、100、200 mg·kg-1·d-1(用 NS配制)。連續(xù)給藥10 d。

1.2.4 對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率的影響 末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死，常規(guī)取實(shí)體瘤稱重，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)的抑制百分率(抑瘤率)。抑瘤率=(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.2.5 caspase-3，8，9活性測(cè)定 將腫瘤組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊，加入冰冷的裂解緩沖液，冰上制備勻漿，勻漿液10 000 r/min，4℃離心5 min后收集上清，測(cè)定其中的蛋白濃度，按照試劑盒操作要求，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)腫瘤組織中caspase3，8，9活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 SPS對(duì) C26結(jié)腸癌小鼠瘤重的影響

50、100和200 mg·kg-1·d-1SPS均能抑制C26結(jié)腸癌在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為13.12%、31.57%和38.55%，顯示出一定的劑量依賴趨勢(shì)，100、200 mg·kg-1·d-1劑量組與模型組相比有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 SPS對(duì)荷瘤小鼠caspase-3，8，9活性的影響

與模型組相比，SPS可以提高荷瘤小鼠腫瘤組織中caspase-3和caspase-9的活性，而且隨著給藥劑量的增加，caspase-3和caspase-9活性逐漸上升，高劑量組活性升高最為明顯，其中 100、200 mg·kg-1·d-1劑量組有顯著性差異(P＜0.01)。SPS各劑量組caspase-8的活性與模型組相比沒(méi)有明顯變化。見表2。

表1 SPS對(duì)C26結(jié)腸癌小鼠瘤重的影響± s，n=10)

表1 SPS對(duì)C26結(jié)腸癌小鼠瘤重的影響± s，n=10)

與模型組比較：1)P＜0.01，下表同

組別 體重(g)治療前 治療后瘤重(g)抑瘤率(%)模型組20.32±0.90 21.48±1.03 0.80±0.18 -5-FU組 20.3±1.20 17.94±1.21 0.35±0.111) 56.00低劑量SPS組 20.24±1.05 21.24±0.91 0.70±0.16 13.12中劑量SPS組 20.09±0.95 22.22±1.01 0.55±0.141) 31.57高劑量SPS組 20.42±0.77 21.12±0.92 0.49±0.121)38.55

表2 SPS對(duì)C26荷瘤小鼠 caspase-3，8，9活性的影響(± s，n=10)

表2 SPS對(duì)C26荷瘤小鼠 caspase-3，8，9活性的影響(± s，n=10)

組別caspase-3 caspase-8 caspase-9模型組0.217±0.088 0.205±0.069 0.261±0.054 5-FU組 0.486±0.0821) 0.546±0.0581) 0.521±0.0841)低劑量SPS組 0.301±0.041 0.22±0.096 0.346±0.082中劑量SPS組 0.338±0.0421) 0.254±0.102 0.527±0.0691)高劑量SPS組 0.416±0.0671) 0.257±0.048 0.657±0.0711)

3 討論

半枝蓮是一種天然草藥，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛、抗癌等功能，民間常用于治療毒蛇咬傷、跌打損傷、吐血、衄血、血淋、水腫、腹水及癌癥等，特別是在癌癥的治療中，臨床上常與白花蛇舌草、半邊蓮等組成復(fù)方配伍用于多種腫瘤的治療。SPS是從半枝蓮中提取的主要有效成分。研究發(fā)現(xiàn)SPS可以抑制S180、H22荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，與環(huán)磷酰胺合用具有增效減毒作用〔6〕，表明SPS具有潛在抗腫瘤研究?jī)r(jià)值。

在本研究中，SPS可以顯著抑制C26結(jié)腸癌荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，并呈一定的劑量依賴趨勢(shì)。腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞的異常增殖和分化有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)，凋亡調(diào)控失調(diào)是腫瘤發(fā)生的重要原因之一〔7〕。放療化療等多種抗腫瘤治療的部分機(jī)制與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)，許多抗腫瘤藥物都在一定程度上可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡〔8〕。因此，我們進(jìn)一步觀察SPS對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3、caspase-8和caspase-9的影響。

caspase-3，是caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)分子，它的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段〔9〕。caspase-8是外源性凋亡途徑的主要蛋白。Fas與FasL(Fas ligand)結(jié)合，將死亡信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)內(nèi)源性Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)生成FasL-Fas-FADD凋亡復(fù)合物，使 caspase-8活化，激活下游的 caspase-3、6、7，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔10〕。caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑的關(guān)鍵分子。當(dāng)線粒體釋放細(xì)胞色素C，與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合，形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，caspase-9被激活，活化的caspase-9能激活其他的caspase如caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔11〕。

本研究結(jié)果顯示SPS可以提高C26結(jié)腸癌荷瘤小鼠腫瘤組織caspase-3和caspase-9的活性，而caspase-8活性沒(méi)有明顯變化，提示caspase-3和caspase-9參與了SPS對(duì)腫瘤的抑制作用，SPS可能通過(guò)線粒體啟動(dòng)的內(nèi)源性凋亡途徑，活化caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。

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Effect of Scutellaria barbata polysaccharides on caspase-3，8，9 activity in C26 tumor bearing mice

YE Hua，GUO Meng，WU Qiong，et al.
Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，Guangdong，China

Objective To study the effect of Scutellaria barbata polysaccharides(SPS)on caspase-3，8，9 activity in C26 tumor bearing mice.Methods The C26 tumor bearing mouse model was established and the inhibitory rate of SPS was detected.The activity of caspase-3，8，9 were monitored by spectrophotometry.Results Compared with model group，SPS inhibited the development of transplanted tumor in mice，increased the activity of caspase-3 and caspase-9，but did not change the activity of caspase-8.Conclusions SPS maybe induce tumor apoptosis by activating caspase-9，then activate caspase-3.

Scutellaria barbata polysaccharides;Caspases;Apoptosis;Tumor

R966

A 〔

1005-9202(2012)23-5152-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.025

國(guó)家自然科學(xué)基金(30772701);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B03170065);廣東省建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省項(xiàng)目(20112144);湛江市科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009C3104003)

1 廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室

鄭學(xué)寶(1964-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，博士，主要從事中藥及中藥復(fù)方藥理學(xué)研究。

葉 華(1980-)，女，碩士，主要從事抗腫瘤和抗炎免疫藥理學(xué)研究。

〔2012-07-30收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)