王淑英 李慧玲 李文 侯麗然 張輝 原德新 斗章

缺血-再灌注損傷是在缺血性損傷的基礎上發(fā)展而來的，涉及許多疾病的發(fā)病機制并影響其愈后。再灌注可以使可逆性缺血加重，即可能促進可逆性缺血損傷轉化為不可逆性損傷。尋找有效的防治腦缺血再灌注損傷藥物已成為國內(nèi)外的研究熱點[1，2]。本實驗運用電鏡、光化學分析方法研究EGB對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的影響，以期在腦缺血-再灌注損傷的預防與治療中為EGB的開發(fā)和臨床應用提供足夠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 健康Wistar大鼠75只，體重280～380 g，雌雄不限，隨機分為3組。動物由佳木斯大學實驗動物中心提供。動物術前12 h禁食，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 隨機將大鼠分為假手術組(Sham組):25只，做動脈分離手術，不栓塞大腦中動脈;缺血-再灌注組(I/R組):25只，大腦中動脈栓塞2 h，再灌注24 h;EGB干預組(EGB+I/R):25只，對其進行大腦中動脈栓塞2 h，栓塞后2 min內(nèi)尾靜脈注射 EGB(20 mg/kg)，再灌注24 h，其間給3次藥。

1.2.2 實驗動物模型的制備及干預 參照Nagasawa、汪家龍、馬常升等[3-5]報道的方法，采用頸內(nèi)動脈插入線栓法造模。Wistar大鼠用3.5%水合氯醛(350 mg/kg，腹腔注射)麻醉，仰臥固定。切開頸部正中皮膚，鈍性游離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，仔細分離以免刺激迷走神經(jīng)。由CCA分叉處向頭端依次游離，并用電熱燒灼器燒斷頸外動脈所有分枝，使其主干游離備用。然后分離ICA至顱底，并分離出 ICA顱外段的惟一分支翼腭動脈(PPA)。用蛙心夾夾住CCA和ICA，并在ECA(靠近CCA分叉處)上剪一小口，將一端涂有聚氨酯的栓子(預先蘸有肝素鈉溶液)沿切口插入ECA，經(jīng)CCA分叉處并將預先放置于ECA根部的手術縫合線扎緊，以防止其中的栓子滑出和出血，然后放開ICA上的蛙心夾，將栓子緩慢地向ICA入顱方向推進約19～21 mm，微遇阻力即停，使栓子頭端停留在大腦中動脈(MCA)與大腦前動脈(ACA)分叉處。固定栓子，即完成一側MCA的栓塞。栓塞2 h后，緩慢的輕拉栓子使其頭端回到ECA內(nèi)，可實現(xiàn)MCA再灌注。假手術組除不插線外，全過程同模型組。術后2 min尾靜脈給藥，20 mg/kg，3次/d，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水。各組大鼠均在再灌注24 h后取材。

1.2.3 神經(jīng)病學評分 參考Kuluz[6]神經(jīng)缺陷三級評分標準，動物清醒后分別在對應時點進行評分。標準如下:0級:無缺陷，活動正常;Ⅰ級:右側Horner's征陽性;Ⅱ級:提尾懸空時左前肢曲屈、內(nèi)收;Ⅲ級:自主運動時向偏癱側(左側)劃圈。腦缺血后，上述Ⅰ～Ⅲ級三項體征均出現(xiàn)的大鼠，才視為造模成功，進入下一步試驗。

2.4 電鏡標本觀察 再灌注24 h后，將動物斷頭，迅速取右腦，將其修成1 mm×1 mm×1 mm小塊，用2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液固定，丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片，厚50 nm，醋酸鈾染色觀察線粒體及核膜變化。

2.5 SOD和MDA的測定 2.5.1 樣本處理 大鼠腦缺血-再灌注至24 h后，迅速斷頭取右腦，在冰盤中以腦組織(mg):生理鹽水(ml)=10∶1的比例，在盛有冰塊的器皿中用玻璃勻漿器碾磨成腦勻漿，4℃3000 r/min離心機離心20 min，取上清液于～30℃以下保存待測。

2.5.2 SOD測定 采用黃嘌呤氧化酶發(fā)光法。

2.5.3 MDA的測定 用硫代巴比妥酸法(TAB)測定。

2.6 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計處理 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)計算機運用SPSS軟件處理，組間采用方差分析，組內(nèi)采用獨立樣本檢驗。所有結果以均值標準差表示，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 結果

3.1 線粒體電鏡觀察 假手術組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)線粒體較多，呈圓形或橢圓形，內(nèi)嵴排列整齊、清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布，表面有密集的核糖體附著，核膜結構完整(圖1);缺血2 h再灌注24 h，電鏡下神經(jīng)細胞內(nèi)細胞器明顯減少，胞漿內(nèi)線粒體腫大，嵴變短或減少、消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也擴張，其上的核糖體脫失，胞漿中糖原減少，自噬泡增多，核膜不完整或缺失(圖2);EGB干預組核膜結構與正常組無明顯差別，線粒體稍有輕度腫脹，與缺血-再灌注組比較明顯減輕(圖3)。

圖1 假手術組線粒體電鏡像20 k

圖2 模型組線粒體電鏡像20 k

圖3

3.2 SOD和MDA水平的變化(見表1)。

表1 大鼠SOD和MDA水平的變化(±s)

表1 大鼠SOD和MDA水平的變化(±s)

注:給藥組與假手術組相比，P＜0.05;與模型組相比，P＜0.05

SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)假手術組150.75±8.95 1.20±0.21 191.17±19.15 1.12±0.06模型組 87.48±16.67 2.02±0.87給藥組

4 討論

線粒體是細胞氧化磷酸化反應的主要部位，再灌注時，線粒體氧化磷酸化功能障礙，損傷的電子傳遞鏈成為氧自由基的重要來源。缺血、缺氧使ATP含量減少，Ca2+進入線粒體增多，使線粒體功能受損，細胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，以致進入細胞內(nèi)的氧經(jīng)單電子還原而形成的氧自由基增多，而經(jīng)4價還原生成的水減少。有學者[7]認為Ca2+進入線粒體可使錳-超氧化物歧化酶減少，對自由基的清除能力降低，進而使自由基含量增加。氧自由基主要包括超氧自由基(O-2·)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(HO·)和單線態(tài)氧等。O-2·等活性氧的主要毒性作用是直接損傷細胞膜，使多不飽和脂肪酸過氧化，也使具有膜結構的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、線粒體等結構破壞，導致一系列功能紊亂，從而誘導某些疾病的發(fā)生[8]。

脂質(zhì)過氧化作用形成的脂氫過氧化物，在過氧化條件下易分解生成MDA以及新的自由基等。MDA能帶著原自由基的損傷潛能[9]，從它生成的部位擴散到其他細胞成份，甚至能從細胞逸出，帶著自由基的損傷潛入到其他細胞，引起細胞損傷[10]。

生物體為了防止這些毒性效應，形成了一個完整的抗氧化防御系統(tǒng)。機體中的抗氧化酶主要有SOD和各種過氧化物酶。SOD可催化O-2·生成H2O2和O2，減少O-2·對組織的損傷。SOD被認為是人體內(nèi)消除 O-2·毒性效應的最重要保護酶，其可減少O-2·對細胞內(nèi)含巰基的蛋白質(zhì)的損傷，防止酶失活。SOD可干擾吞噬細胞生成的O-2·有利于損傷的修復。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注后，其腦組織內(nèi)SOD活性明顯下降，而MDA含量卻明顯升高，線粒體損傷較嚴重?？赡苁悄X缺血再灌注后，腦內(nèi)缺氧、脂質(zhì)過氧化作用加強所致。提示，腦缺血再灌注后可使腦抗氧化能力降低。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，EGB治療組腦組織內(nèi)SOD活性較模型組明顯增加，而MDA的含量明顯下降，線粒體損傷較輕。這可能是由于EGB通過改善細胞氧化磷酸化反應，使SOD活性增強，對自由基的清除能力增強，進而使自由基含量降低，從而對缺血-再灌損傷的腦組織起到保護作用。

[1]陳芬芳，湯永紅.Bcl-2與腦缺血-再灌注損傷關系的研究進展.醫(yī)學信息(上旬刊)，2011，24(2):821-822.

[2]黃昕艷，張道春，陳麗.納洛酮對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷后的腦保護作用.心血管康復醫(yī)學雜志，2008，17(2):162-164.

[3]Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion.Stroke，1989，20:1037-1043.

[4]汪家龍，劉才棟.實驗性急性腦缺血模型及其研究進展.解剖科學進展，1999，15(3):212-214.

[5]馬常升，馬文領.插線法制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型的研究.解剖學雜志，1999，22(3):209-213.

[6]Kuluz JW，Prado RJ，Dietrich D，et al.The effect of nitric oxide synthase inhibition on infarct volume after reversible focal ischemia in conscious rats.Stroke，1993，24:2023.

[7]陳曄，王文宇，王致喻，等.局部缺血貓腦的透射電鏡觀察.中國神經(jīng)精神疾病雜志，1991，17:139.

[8]Bulkley G B.Free radical-mediated reperfusion injury:a selective r eview.Br J Cancer，1987，55:66-78.

[9]Esterbauer H.Aldehydic products of lipid peroxidation.In Free Rad icals，Lipid Peroxidation and Cancer.London:Acadenlic Press，1982:101-128.

[10]Halliwell B and Gufferidge J M C.Free radicals in biology and medicine.Oxford Clarendon Press，1989:196-226.