閆曉笑 韓沖芳 范作雷 李婧

有研究表明，NF-κB和TNF-α誘導參與炎癥反應，是心肌缺血再灌注損傷的重要原因［1，2］。七氟烷預處理可通過抑制NF-κB的活性，下調炎癥細胞因子TNF-α的表達水平，減輕心肌缺血灌注的炎癥反應，發(fā)揮心肌保護作用［3］。七氟烷后處理對心肌有保護作用［4，5］，但其機制還未完全闡明。因此，本實驗通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，觀察不同濃度的七氟烷后處理對大鼠心肌組織的NF-κB和血清中TNF-α的影響，探討其減輕心肌缺血再灌注損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組 健康Wistar雄性大鼠40只，體重180～220 g，由山西醫(yī)科大學生理實驗室提供。隨機分為5組(n=8):假手術組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、1.0%、2.0%、3.0%七氟烷后處理組(S1、S2、S3組)。P組僅穿線不結扎左冠狀動脈前降支(LAD)維持150 min。I/R組結扎30 min，再灌注120 min。S1、S2、S3組在再灌注前 15 min 分別吸入1.0%、2.0%、3.0%七氟烷(丸石制藥株式會社)，其余操作同I/R組。

1.2 模型制備 參照文獻［5］介紹的方法建立大鼠在體心肌缺血再灌注模型。200 g/L的烏拉坦0.5 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位固定于鼠板，氣管切開，連接動物呼吸機(潮氣量10～15 ml/kg，呼吸頻率60～70次/min，吸呼比1∶2)，連接生物定量分析系統(tǒng)記錄心電圖。在胸骨左緣0.5 cm，第3，4肋間暴露心臟。用7-0絲線在左心耳根部下方2 mm處進針，穿過心肌表層肺動脈圓錐稍下方處穿線，絲線兩端穿過聚乙烯小管(1.5～2.0 mm)，拉緊細線，用止血鉗夾閉小管，即可阻斷LAD。心電圖示ST弓背向上抬高≥0.1 mV，結扎線下心肌組織發(fā)紺，說明心肌缺血模型成功。30 min后，松開止血鉗，使LAD恢復血流，ST段下降1/2以上，發(fā)紺區(qū)逐漸變紅，說明心肌已恢復再灌注。結扎前出現(xiàn)心電圖不正?；蛭吹接^察終點而死亡的大鼠排除本研究。

1.3 標本采集 再灌注2 h后，腹主動脈抽血2 ml，置于抗凝管中，用低速離心機(3000 r/min)離心15 min，取上清液置于EP管中，-70℃保存，以備雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測TNF-α含量。再灌注2 h后，剪下心肌組織，迅速分離出左心室，置于10%中性甲醛24 h后，石蠟包埋，切片，保存以備HE染色和免疫組化測NF-κB。

1.4 HE染色 石蠟切片脫蠟酒精水化，蘇木素液復染，1%鹽酸乙醇返藍，伊紅乙醇處理，脫水，透明，封片，光鏡下觀察心肌組織的病理形態(tài)學變化。

1.5 測NF-κB 石蠟切片脫蠟酒精水化，枸櫞酸修復，3%H2O2室溫封閉10 min，PBS緩沖液沖洗，滴加一抗Rabbit Anti-NFkBp65(北京博奧森生物技術有限公司)，4℃過夜。PBS沖洗，滴加PV-6001/6002/6003兩步法免疫組化試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)，10 min后，PBS沖洗，滴加DAB顯色劑，鏡下觀察終止顯色。流水沖洗，蘇木素液復染，1%鹽酸乙醇返藍，常規(guī)脫水透明封片。光鏡下觀察，陽性反應為細胞漿和(或)細胞核呈棕黃色。每張切片隨機選取5個視野，利用圖像分析系統(tǒng)分析陽性區(qū)域平均光密度值，代表NF-κB的活性表達水平。

1.6 測TNF-α 按照 Rat TNF-α ELISA Kit試劑(北京四正柏生物科技有限公司)說明書檢測血清中TNF-α的含量。在450 nm下測OD值，TNF-α濃度與OD450值之間呈正比，繪制標準曲線計算標本中TNF-α濃度(pg/ml)。

1.7 統(tǒng)計學方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌組織的病理形態(tài)學變化 光鏡下觀察心肌組織病理變化。C組心肌細胞排列整齊，呈束狀，細胞形態(tài)正常，細胞間質無水腫。I/R組心肌細胞排列紊亂，細胞腫脹明顯，細胞間質水腫明顯。S1、S2組心肌病理變化基本相同，介于I/R組和S2組間。S2組心肌細胞排列基本整齊，細胞輕度水腫，部分細胞間質水腫輕度增寬。

2.2 各組NF-κB的變化 與C組相比，I/R組、各 S組NF-κB的活性顯著升高(P＜0.05);與I/R組相比，各S組NF-κB的活性顯著降低(P＜0.05);S1組與S3組各指標間無明顯差異(P ＞0.05);與 S1組、S3組相比，S2組 NF-κB 的活性顯著降低(P＜0.05)(表1)。

2.3 各組TNF-α的變化 與C組相比，I/R組、各S組TNF-α濃度顯著升高(P＜0.05);與I/R組相比，各S組TNF-α濃度均顯著降低(P＜0.05);S1組與S3組各指標間無明顯差異(P ＞0.05);與 S1組、S3組相比，S2組 TNF-α 濃度顯著降低(P＜0.05)(表1)。

表1 各組大鼠TNF-α濃度、NF-κB活性的比較(±s)

表1 各組大鼠TNF-α濃度、NF-κB活性的比較(±s)

注:與C組相比，aP＜0.05;與 I/R組相比，bP＜0.05;與S1和S3組相比，cP＜0.05

組別 n TNF-α(pg/ml) NF-κB C組843.49±4.20 0.20±0.01 I/R組 8 83.72±5.51a 0.37±0.15a S1組 8 76.13±6.21ab 0.33±0.01ab S2組 8 68.94±6.63abc 0.28±0.01abc S3組 8 75.58±6.59ab 0.32±0.02ab

3 討論

本實驗參照文獻［5］采用結扎左冠狀動脈前降支30 min，恢復血流120 min的方法制備心肌缺血再灌注模型，結果表明，I/R組NF-κB的活性及TNF-α濃度較C組顯著升高，結合心電圖和病理學結果，提示模型制備成功。參照文獻［6］采用1.0%、2.0%、3.0%作為七氟烷濃度。

心肌缺血再灌注損傷是一個作用機制復雜的病理生理過程。有研究表明，抑制炎癥反應可減輕心肌缺血再灌注損傷［1］。TNF-α是一個多功能性的細胞因子，在炎癥反應過程中發(fā)揮著重要作用，是其他炎癥細胞因子的上游誘導者，引起細胞因子的級聯(lián)反應，導致心肌缺血再灌注損傷［7］。本實驗結果顯示，與C組相比，I/R組TNF-α濃度顯著升高;與I/R組相比，七氟烷后處理組(S1、S2和S3組)血清 TNF-α的表達和產生明顯降低，提示七氟烷后處理抑制TNF-α的產生，減輕炎癥反應，來保護心肌損傷。

NF-κB是廣泛存在于多種細胞中的核轉錄因子，誘導促炎細胞因子TNF-α的表達，發(fā)生炎癥反應［8］。許多研究證實，心肌缺血再灌注能夠誘發(fā)NF-κB活化，并且NF-κB活化及其誘發(fā)的炎癥級聯(lián)反應可促進心肌損傷的發(fā)生［1，2，9］。本實驗I/R組NF-κB的活性及TNF-α的濃度明顯升高支持這一點。而下調NF-κB的活性，則可抑制TNF-α等促炎性因子的過度表達，抑制炎癥反應，減輕心肌損傷［3］。結果表明，與I/R組相比，S1組、S2組和S3組大鼠心肌組織NF-κB的活性降低，血清TNF-α的表達降低，提示七氟烷后處理可通過抑制NF-κB的活性，降低TNF-α的表達水平，從而減輕心肌缺血灌注的炎癥反應，是其后處理的保護作用機制之一。但七氟烷后處理通過何種途徑激活NF-κB的活性，有待進一步探討。

研究結果表明，S2組NF-κB活性及TNF-α濃度較S1組、S3組相比顯著降低，而S1組、S3組相比各指標間無明顯差異，提示濃度為2.0%的七氟烷對心肌的保護效果最佳。

綜上所述，七氟烷后處理可通過抑制大鼠心肌組織中NF-κB的活性，降低血清TNF-α的表達水平，達到心肌保護作用，且濃度為2.0%的效果最佳。

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