沈 景,宋利強
中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)學院病理系,北京 100005
·技術(shù)與方法·
改良TRIzol法提取腫瘤細胞瓊脂克隆的總RNA
沈 景,宋利強
中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)學院病理系,北京 100005
TRIzol;瓊脂克隆形成實驗;RNA提取;多糖
瓊脂克隆形成實驗是腫瘤研究領(lǐng)域中一種重要的體外實驗,可用于篩選轉(zhuǎn)化細胞、評價腫瘤細胞藥物敏感性[1]等。有研究表明,瓊脂克隆形成實驗篩選的腫瘤細胞具有腫瘤干細胞的特性[2],有更強的致瘤性和轉(zhuǎn)移能力[3]。因而腫瘤細胞瓊脂克隆的基因表達分析,對研究腫瘤干細胞的基因表達特征、分子標志及耐藥機制有重要意義。但提取的瓊脂克隆RNA被瓊脂糖嚴重污染,瓊脂糖又阻礙逆轉(zhuǎn)錄反應的進行[4-5],使所提RNA難以用于基因表達分析。本實驗將F9細胞與瓊脂糖凝膠混合以模擬瓊脂克隆,以建立有效去除瓊脂糖污染、提取高質(zhì)量RNA的方法,并通過提取M5076瓊脂克隆的RNA進行驗證。
材料F9小鼠畸胎瘤細胞株購自中國醫(yī)學科學院細胞中心;M5076小鼠卵巢網(wǎng)狀細胞肉瘤細胞株由美國癌癥研究所贈送; PBS、細胞培養(yǎng)基及血清購自Hyclone公司; TRIzol 總RNA提取試劑、低熔點超純瓊脂糖購自上海英駿公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。
F9細胞總RNA的提取將對數(shù)生長期的F9細胞收集至離心管,約4×107細胞沉淀與1.5 g 1%的瓊脂糖凝膠混合,加入13 ml TRIzol裂解細胞,取其中12 ml分裝入12個無RNA酶的 1.5 ml離心管,分成對照組、PBS預處理組、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)水預處理組和0.2 mol/L醋酸鉀溶液預處理組,每組3管。對照組直接用TRIzol提取RNA;其他3組每管緩慢加入1/4體積預冷至4℃的相應預處理液,-80℃放置30 min, 4℃、12 000×g離心10 min后取上清,再按TRIzol說明書進行提取。
軟瓊脂克隆形成實驗將M5076單細胞懸液接種于6孔板的雙層瓊脂培養(yǎng)基中,底層、上層瓊脂糖濃度分別為0.6%和0.5%。每孔加入0.5 ml含17%馬血清的1640培養(yǎng)基,隔天換液,于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 d[6]。
M5076細胞瓊脂克隆RNA的提取將瓊脂克隆挑出,加入5倍體積的TRIzol裂解細胞,分裝入無RNA酶的 1.5 ml離心管。每管加入1/4體積預冷至4℃的PBS,-80℃放置30 min, 4℃、12 000×g離心10 min后取上清,按TRIzol說明書進行提取。
RNA純度和質(zhì)量鑒定檢測RNA紫外吸收特性,以A260/A280評估蛋白質(zhì)污染、A260/A230評估多糖及酚類污染;甲醛變性膠電泳檢測RNA有無降解; RT-PCR檢測RNA能否用于逆轉(zhuǎn)錄反應,擴增的基因為GAPDH,引物序列為:上游引物:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’;下游引物 : 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。 PCR反應條件為:95℃變性30 s, 68℃復性30 s, 68℃延伸90 s, 35個循環(huán)后72℃延長10 min,于4℃保存。
統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行兩組獨立樣本t檢驗,檢驗標準為Plt;0.05。
F9細胞RNA純度和完整性對照組RNA樣品中,瓊脂糖與RNA共沉淀導致RNA沉淀難于溶解,加熱助溶后又形成凝膠,只得到少量的RNA溶液。對照組、各預處理組的A260/A280均大于1.8;對照組A260/A230為0.76±0.20,各處理組均大于2.0;對照組A260/A230與PBS組、DEPC水組、醋酸鉀溶液組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001,P=0.009,P=0.038)。變性膠電泳顯示,各預處理組均得到了清晰的28S、18S核糖體RNA條帶,其亮度比約為2∶1;醋酸鉀溶液處理組有基因組DNA污染及RNA降解;DEPC水處理組亦有少量基因組DNA污染(圖1)。
M5076瓊脂克隆RNA純度和完整性M5076細胞瓊脂克隆3個重復樣品總 RNA的A260/A280分別為1.97、1.97、1.96,均大于1.9;A260/A230為2.25、2.26、2.3,均大于2.2。變性膠電泳顯示, 28S和18S 核糖體RNA條帶清晰,亮度約為2:1(圖2)。
RT-PCR檢測M5076瓊脂克隆RNA的生物活性總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后,通過PCR擴增了451bp的GAPDH基因片段(圖3)。
1:對照組;2:PBS預處理組;3:焦碳酸二乙酯水預處理組;4:醋酸鉀溶液預處理組圖1 F9細胞對照組和各處理組RNA電泳
1、2、3為3個重復樣品圖2 M5076瓊脂克隆總RNA電泳
1、2、3為3個重復樣品圖3 RT-PCR擴增的GAPDH基因片段
根據(jù)干細胞領(lǐng)域的理論,瓊脂培養(yǎng)基中生長的細胞克隆,一旦轉(zhuǎn)到普通平皿中培養(yǎng)即發(fā)生分化而失去干細胞特性[7],基因表達特征隨之改變。因而,直接提取瓊脂克隆的RNA做基因芯片、逆轉(zhuǎn)錄 PCR等基因表達分析,對研究腫瘤干細胞的基因表達特征具有重要意義。提取瓊脂克隆RNA的難點,在于瓊脂糖能與RNA共沉淀[4],商業(yè)化試劑盒均無法將其有效去除[8]。
F9細胞模擬瓊脂克隆實驗中, PBS去除瓊脂糖污染的效果比DEPC水、醋酸鉀溶液為好,因此本實驗建立了一種通過PBS稀釋TRIzol細胞裂解液、-80℃冷凍、低溫高速離心等手段去除瓊脂糖污染的方法,提取了M5076腫瘤細胞瓊脂克隆的高質(zhì)量RNA,并以RT-PCR方法驗證了所提RNA能夠用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應。本方法將為腫瘤細胞瓊脂克隆的基因表達研究提供有力的工具,對干細胞、腫瘤干細胞領(lǐng)域的研究提供幫助,也對某些富含多糖植物的RNA提取有一定的啟示。
[1]Salmon SE, Hamburger AW, Soehnlen B. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs [J]. N Engl J Med, 1978, 298(24):1321-1327.
[2]Dou J, Pan M, Wen PL, et al. Isolation and identification of cancer stem-like cells from murine melanoma cell lines [J]. Cell Mol Immunol, 2007, 4(6):467-472.
[3]Li L, Price JE, Fan D,et al. Correlation of growth capacity of human tumor cells in hard agarose with theirinvivoproliferative capacity at specific metastatic sites [J]. J Natl Cancer Inst, 1989, 81(18):1406-1412.
[4]Falc?o VDR, Tonon AP, Oliveira MC, et al. RNA isolation method for polysaccharide rich algae: agar producing Gracilaria tenuistipitata [J]. J Appl Phycol, 2008, 20(1):9-12.
[5]Li B, Wang B, Tang K, et al. A simple and convenient approach for isolating RNA from highly viscous plant tissue rich in polysaccharides[J].Colloids Surf B Biointerfaces, 2006, 49(2):101-105.
[6]Li X, Pan Y, Fan R, et al. Adenovirus-delivered CIAPIN1 small interfering RNA inhibits HCC growthinvitroandinvivo[J]. Carcinogenesis, 2008, 29(8):1587-1593.
[7]Xudong S, Jerry G, Wade B. Anchorage-independent culture maintains prostate stem cells [J]. Dev Biol, 2007, 312(1):396-406.
[8]Chunming W, Jinghua H, Feng Z, et al. RNA extraction from polysaccharide-based cell-laden hydrogel scaffolds [J]. Anal Biochem, 2008, 380(2):333-334.
沈 景 電話:010-65295992,電子郵件:sdshenjing@163.com
R-331
B
1000-503X(2012)02-0190-03
10.3881/j.issn.1000-503X.2012.02.017
2011-03-28)