沈 景，宋利強

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)學院病理系，北京 100005

·技術(shù)與方法·

改良TRIzol法提取腫瘤細胞瓊脂克隆的總RNA

沈 景，宋利強

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)學院病理系，北京 100005

TRIzol；瓊脂克隆形成實驗；RNA提取；多糖

瓊脂克隆形成實驗是腫瘤研究領(lǐng)域中一種重要的體外實驗，可用于篩選轉(zhuǎn)化細胞、評價腫瘤細胞藥物敏感性[1]等。有研究表明，瓊脂克隆形成實驗篩選的腫瘤細胞具有腫瘤干細胞的特性[2]，有更強的致瘤性和轉(zhuǎn)移能力[3]。因而腫瘤細胞瓊脂克隆的基因表達分析，對研究腫瘤干細胞的基因表達特征、分子標志及耐藥機制有重要意義。但提取的瓊脂克隆RNA被瓊脂糖嚴重污染，瓊脂糖又阻礙逆轉(zhuǎn)錄反應的進行[4-5]，使所提RNA難以用于基因表達分析。本實驗將F9細胞與瓊脂糖凝膠混合以模擬瓊脂克隆，以建立有效去除瓊脂糖污染、提取高質(zhì)量RNA的方法,并通過提取M5076瓊脂克隆的RNA進行驗證。

材料和方法

材料F9小鼠畸胎瘤細胞株購自中國醫(yī)學科學院細胞中心；M5076小鼠卵巢網(wǎng)狀細胞肉瘤細胞株由美國癌癥研究所贈送； PBS、細胞培養(yǎng)基及血清購自Hyclone公司； TRIzol 總RNA提取試劑、低熔點超純瓊脂糖購自上海英駿公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。

F9細胞總RNA的提取將對數(shù)生長期的F9細胞收集至離心管，約4×107細胞沉淀與1.5 g 1%的瓊脂糖凝膠混合，加入13 ml TRIzol裂解細胞，取其中12 ml分裝入12個無RNA酶的 1.5 ml離心管，分成對照組、PBS預處理組、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)水預處理組和0.2 mol/L醋酸鉀溶液預處理組，每組3管。對照組直接用TRIzol提取RNA；其他3組每管緩慢加入1/4體積預冷至4℃的相應預處理液，-80℃放置30 min， 4℃、12 000×g離心10 min后取上清，再按TRIzol說明書進行提取。

軟瓊脂克隆形成實驗將M5076單細胞懸液接種于6孔板的雙層瓊脂培養(yǎng)基中，底層、上層瓊脂糖濃度分別為0.6%和0.5%。每孔加入0.5 ml含17%馬血清的1640培養(yǎng)基，隔天換液，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 d[6]。

M5076細胞瓊脂克隆RNA的提取將瓊脂克隆挑出，加入5倍體積的TRIzol裂解細胞，分裝入無RNA酶的 1.5 ml離心管。每管加入1/4體積預冷至4℃的PBS，-80℃放置30 min， 4℃、12 000×g離心10 min后取上清，按TRIzol說明書進行提取。

RNA純度和質(zhì)量鑒定檢測RNA紫外吸收特性，以A260/A280評估蛋白質(zhì)污染、A260/A230評估多糖及酚類污染；甲醛變性膠電泳檢測RNA有無降解； RT-PCR檢測RNA能否用于逆轉(zhuǎn)錄反應，擴增的基因為GAPDH，引物序列為：上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’;下游引物 : 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。 PCR反應條件為：95℃變性30 s, 68℃復性30 s, 68℃延伸90 s， 35個循環(huán)后72℃延長10 min，于4℃保存。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行兩組獨立樣本t檢驗，檢驗標準為Plt;0.05。

結(jié) 果

F9細胞RNA純度和完整性對照組RNA樣品中，瓊脂糖與RNA共沉淀導致RNA沉淀難于溶解，加熱助溶后又形成凝膠，只得到少量的RNA溶液。對照組、各預處理組的A260/A280均大于1.8；對照組A260/A230為0.76±0.20，各處理組均大于2.0;對照組A260/A230與PBS組、DEPC水組、醋酸鉀溶液組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001，P=0.009，P=0.038)。變性膠電泳顯示，各預處理組均得到了清晰的28S、18S核糖體RNA條帶，其亮度比約為2∶1；醋酸鉀溶液處理組有基因組DNA污染及RNA降解；DEPC水處理組亦有少量基因組DNA污染(圖1)。

M5076瓊脂克隆RNA純度和完整性M5076細胞瓊脂克隆3個重復樣品總 RNA的A260/A280分別為1.97、1.97、1.96，均大于1.9；A260/A230為2.25、2.26、2.3，均大于2.2。變性膠電泳顯示， 28S和18S 核糖體RNA條帶清晰，亮度約為2:1(圖2)。

RT-PCR檢測M5076瓊脂克隆RNA的生物活性總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，通過PCR擴增了451bp的GAPDH基因片段(圖3)。

1：對照組；2：PBS預處理組；3：焦碳酸二乙酯水預處理組；4：醋酸鉀溶液預處理組圖1 F9細胞對照組和各處理組RNA電泳

1、2、3為3個重復樣品圖2 M5076瓊脂克隆總RNA電泳

1、2、3為3個重復樣品圖3 RT-PCR擴增的GAPDH基因片段

討 論

根據(jù)干細胞領(lǐng)域的理論，瓊脂培養(yǎng)基中生長的細胞克隆，一旦轉(zhuǎn)到普通平皿中培養(yǎng)即發(fā)生分化而失去干細胞特性[7]，基因表達特征隨之改變。因而，直接提取瓊脂克隆的RNA做基因芯片、逆轉(zhuǎn)錄 PCR等基因表達分析，對研究腫瘤干細胞的基因表達特征具有重要意義。提取瓊脂克隆RNA的難點，在于瓊脂糖能與RNA共沉淀[4]，商業(yè)化試劑盒均無法將其有效去除[8]。

F9細胞模擬瓊脂克隆實驗中， PBS去除瓊脂糖污染的效果比DEPC水、醋酸鉀溶液為好，因此本實驗建立了一種通過PBS稀釋TRIzol細胞裂解液、-80℃冷凍、低溫高速離心等手段去除瓊脂糖污染的方法，提取了M5076腫瘤細胞瓊脂克隆的高質(zhì)量RNA，并以RT-PCR方法驗證了所提RNA能夠用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應。本方法將為腫瘤細胞瓊脂克隆的基因表達研究提供有力的工具，對干細胞、腫瘤干細胞領(lǐng)域的研究提供幫助，也對某些富含多糖植物的RNA提取有一定的啟示。

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沈 景 電話：010-65295992，電子郵件：sdshenjing@163.com

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1000-503X(2012)02-0190-03

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.02.017

2011-03-28)