楊珍珍 張莉萍

（山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西 太原 030001）

盡管中耳膽脂瘤的成因及其上皮的來源仍存在很多爭議，但基本達成共識的是膽脂瘤的形成與機體為防御慢性炎癥而產(chǎn)生的一系列異常免疫應答有關。免疫反應的異常是造成膽脂瘤持續(xù)發(fā)展和骨質破壞的內(nèi)在重要因素[1,2]。Toll樣受體（toll.1ikereceptors，TLRs）是先天性免疫模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）之一，通過識別病原微生物及其細胞壁產(chǎn)物的特殊結構即病原相關分子模式（pathogen associated molecularpatterns，PAMPs）迅速激活天然免疫系統(tǒng)[3]?，F(xiàn)Szczepanski等[4]研究發(fā)現(xiàn)TLR（TLR-2，TLR-3，TLR-4）在膽脂瘤微環(huán)境中表達豐富，提示TLR4可能參與膽脂瘤型中耳炎的發(fā)病。本實驗擬用RT-PCR法觀察中耳膽脂瘤組織中TLR4的變化及其下游傳導分子MyD88的表達，進一步探討TLR4信號轉導途徑在中耳膽脂瘤發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本

中耳炎組標本組織來自山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科住院患者35例（男13例，女22例，年齡16～62歲）平均37.12歲，耳流膿史1個月～30年，平均5.14年；聽骨無破壞者8例，破壞1個8例，破壞2個13例，破壞3個6例。在術中取標本時根據(jù)顯微鏡下所見上皮下基質炎性反應的程度，取樣分為炎癥組和非炎癥組，其中炎癥組13份，非炎癥組12份。對照組為正常外耳道皮膚組織10例，亦取自中耳術中。上述所有標本在顯微鏡下仔細剔除膽脂瘤鱗屑及其他壞死組織，置于一80℃冰箱保存，用作RT-PCR檢測。所有患者術前均行顳骨高分辨CT檢查，術后病理活檢均證實為后天繼發(fā)性膽脂瘤。

1.2 主要試劑與儀器

RT-PCR相關試劑（TAKARA公司）.引物合成（深圳華大基因研究所），引物序列如表1。PCR擴增儀為STRATAGENE公司產(chǎn)品。

表1 3種基因的引物序列及產(chǎn)物基因

1.3 總RNA制備和逆轉錄

取組織50mg，加入1mL Trizol，超聲勻漿。加入200μL氯仿，劇烈振蕩混勻30s，于4℃ 12000rpm離心5min，將上清液移入另一EP管中，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，4℃ 12000rpm離心5min以沉淀RNA，用70%乙醇1mL洗滌沉淀2次，4℃ 12000rpm離心2min，EP管底部可得RNA沉淀，用50μL 0.1%DEPC水溶解后可作為反轉錄的模板。cDNA合成按Rever Tra Ace-a-逆轉錄酶試劑盒說明完成。

1.4 實時定量PCR

PCR反應體系為：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）10μL，上游引物（15uM）0.5μL，下游引物（15uM）0.5μL，cDNA 2μL，無DNAse和RNAse的水7μL，共20μL。PCR 反應條件：94℃預變性10min，活化Tag酶；94℃15s，60℃60 s，45個循環(huán)結束。熒光定量PCR讀取CT（cycle threshold）值。

1.5 統(tǒng)計學方法

用2-ΔΔCT法處理實時熒光定量RT-PCR數(shù)據(jù)，采用SPSSl3.0 for windows軟件包處理獲得的數(shù)據(jù)，以Explore過程對數(shù)據(jù)進行探索性分析，由于實驗組標本值2-ΔΔCT不符合正態(tài)分布，以非參數(shù)秩和檢驗進行統(tǒng)計分析。結果以中位數(shù)和最大最小值范圍來表示，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 TLR4水平的改變

炎癥組TLR4平均2-ΔΔCT值分別為0.689（0.200，2.050），非炎癥組TLR4平均2-ΔΔCT值分別為0.291（0.020，0.990），正常對照組TLR4、平均2-ΔΔCT值分別為0.163（0.001，0.990）。見圖1。

圖1 炎癥組、非炎癥組、正常對照組TLR4 mRNA的表達

2.2 MyD88水平的改變

炎癥組為MyD88平均2-ΔΔCT值0.777（0.320，1.84）；非炎癥組MyD88平均2-ΔΔCT值為0.320（0.01，0.990），正常對照組MyD88平均2-ΔΔCT值為0.224（0.002，0.990），見圖2。

圖2 炎癥組、非炎癥組、正常對照組MyD88 mRNA的表達

3 討 論

慢性化膿性中耳炎是耳鼻咽喉科一個常見的疾病，膽脂瘤型中耳炎是中耳慢性化膿性炎的一個類型，發(fā)病率占慢性化膿性中耳炎的20%，它主要以上皮細胞增生、角化上皮脫屑堆積為特征，雖然其不產(chǎn)生與惡性腫瘤同樣的無限增殖，但它可以引發(fā)骨破壞，激發(fā)蝕骨，侵略性地侵蝕中耳及內(nèi)耳的結構，引起嚴重的顱內(nèi)并發(fā)癥，如并不少見的永久性的聽力損失、 前庭功能障礙等，嚴重危害人類健康。大多數(shù)學者把膽脂瘤骨質破壞的機制解釋為慢性炎性作用的結果。Suzuki等[5]發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤囊的破裂可引起局部炎癥和骨質破壞，并伴隨著相同部位小膿腫的形成，他們還觀察到穿孔部位有明顯的炎性細胞浸潤和上皮增殖，說明了膽脂瘤骨質破壞與炎癥之間的聯(lián)系。

馬鑫[6]等研究發(fā)現(xiàn)，膽脂瘤原發(fā)部位的差別對于膽脂瘤的侵襲性沒有明顯影響，主要是伴發(fā)炎性反應的輕重對于膽脂瘤的預后以及侵襲性有明顯影響，膽脂瘤周圍炎性反應越重，侵襲性越強?；谝陨?，了解膽脂瘤的炎癥反應機制，尤為重要。

1997年，Medzhitov等[7]首次在人類細胞表現(xiàn)了Toll樣受體，TLR的發(fā)現(xiàn)對免疫學的發(fā)展產(chǎn)生了積極而深遠的影響。TLR最突出的生物學功能是促進細胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎性反應。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在膽脂瘤微環(huán)境中，有大量TLR4的表達，本研究根據(jù)顯微鏡下觀察膽脂瘤上皮下基質，將中耳膽脂瘤組分為炎癥組和非炎癥組，發(fā)現(xiàn)在炎癥程度強的組織中，有大量的TLR4表達，而在炎癥程度相對較弱的膽脂瘤組織中，有TLR4的表達，但明顯少于炎癥組；相比較膽脂瘤組，正常對照組僅有微量表達。

TLR4識別配體后發(fā)生二聚化，二聚體的刺激信號通過胞內(nèi)Toll/IL-1 R區(qū)（Toll/IL-1 R domain，TIR）傳遞給下游的信號分子經(jīng)過一系列蛋白級聯(lián)反應和磷酸化作用，產(chǎn)生炎性反應[8]。目前發(fā)現(xiàn)TLR4信號通路有2條：一條為MyD88依賴信號途徑，另一條為MyD88非依賴信號途徑。在MyD88依賴途徑中，TLR4寡聚化后募集含TIR（Toll-interleukin-1receptor）結構域的接頭蛋白TIRAP （TIP domain-containing adaptor protein）和MyD88。然后MyD88下游的接頭蛋白IRAK4（IL-1 receptor-associated kinase-4）、TRAF6（TNF report-associated factor 6）和TAKl（TGFβ-activated kinase 1）被募集并活化，而TAKl激活IKK-NF-κB通路和MAPK通路，最終導致前炎性因子的表達[9]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，同TLR4一樣，MyD88在炎癥組中有大量表達，非炎癥組次之，正常對照組有微量表達。說明在膽脂瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，TLR4-MyD88信號轉導途徑可能參與了炎性反應。

本實驗結果顯示在膽脂瘤中耳炎過程中，膽脂瘤組織內(nèi)TLR4、MyD88的表達量隨著炎癥程度的加重而增多。這有助于對人天然免疫和獲得性免疫啟動的認識，并進一步了解TLR4傳導通路在膽脂瘤型中耳炎發(fā)病機制中的作用。而且可以為該病的免疫治療提供理論依據(jù)。如：在膽脂瘤發(fā)病早期（慢性化膿性中耳炎）時就進行免疫干預治療，阻止或延緩疾病的發(fā)展。

[1]Albino AP,Kimmelman CP,Parisier SC.Cholesteatoma: a molecular and cellular puzzle1[J].Am J Otol,1998,19(3):266-272.

[2]林刃輿,遲放魯.中耳膽脂瘤形成機理的研究進展[J].國外醫(yī)學耳鼻咽喉科學分冊,2001,25(3): 153-156.

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[4]Szczepanski M,Szyfter W,Jenek R,et al.Toll-like receptors2,3and4(TLR2,TLR3andTLR4)are expressed in the microenvironment of human acquired cholesteatoma[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,2006,263(7):603-607.

[5]馬鑫,余力生,夏瑞明.不同部位膽脂瘤侵襲性免疫組化的比較[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2006,41(8):574-578.

[6]Suzuki C,Ohtani I.Bone destruction resulting from rup ture of a cholesteatoma sac: temporal bone pathology[J].Otol Neur otol,2004,25(5): 674-677.

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