李 燕 毛善平 翁小東 邢變枝 劉 軍

隨著介入技術的逐漸成熟，腦血管病介入治療漸趨普遍，然而介入治療后的再灌注損傷不容忽視，因此尋找有效的神經(jīng)細胞保護方法是臨床上亟待解決的問題。缺血后處理（Ischemic postconditioning，Postcond）指在缺血發(fā)生后長時間再灌注之前對臟器進行數(shù)次短暫的再灌注／缺血循環(huán)處理方法［1］。它與缺血預處理一樣，能夠減輕再灌注后臟器損傷，由于缺血后處理可在臟器缺血后應用，故比缺血預處理具有更大的臨床應用前景。

Postcond發(fā)生機制尚未完全闡明，目前研究者多采用動物［2］或體外培養(yǎng)神經(jīng)元［3］來模擬Postcond的發(fā)生，研究顯示Postcond可以減小腦梗死的面積，提高動物的神經(jīng)功能及行為評分，減少神經(jīng)元死亡。但在體模型受多種條件的限制，結果也容易受很多因素的干擾。體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元可以使實驗結果避免很多因素的干擾，提高可信度，但原代培養(yǎng)成功率低，神經(jīng)元自然老化等原因致無法保證持續(xù)傳代。SH－SY5Y 細胞系來源于人神經(jīng)母細胞瘤（human neuroblastoma）株，具有類似神經(jīng)元的形態(tài)和生理生化特性，增值迅速，可以連續(xù)穩(wěn)定傳代，是進行體外神經(jīng)系統(tǒng)研究的理想選擇。本研究應用SH－SY5Y 細胞建立缺血再灌注損傷模型，并予以后處理，通過光鏡、熒光顯微鏡以及細胞計數(shù)（Cell Counting Kit－8）法、流式細胞術、SOD 活力檢測細胞從形態(tài)到功能的改變。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

SH－SY5Y 細胞購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司；Cell Counting Kit－8（CCK－8）試劑盒購于日本同仁化學研究所；Annexin V－FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購于上海BestBio貝博生物；超氧化物歧化酶（SOD）WST－1法測定試劑盒購于南京建成有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 裂解液（強）、Hoechst33342試劑購于碧云天生物技術研究所。

三氣培養(yǎng)箱（長沙華曦電子科技有限公司），酶標儀（Perkin Elmer），倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯），流式細胞儀（Beckman Counter）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

SH－SY5Y 細胞用DMEM／F12培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 U／ml青霉素及100 mg／ml鏈霉素于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2 d換液1次，3～4 d傳代1次，傳代時用0.25%胰酶室溫消化1 min。

1.2.2 缺血后處理模型構建

取對數(shù)生長期的SH－SY5Y 細胞以1.5×105／孔接種于直徑為35 mm 的培養(yǎng)皿中，待細胞完全貼壁后棄培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，分為3 組分別為正常組、缺血再灌注組、缺血后處理組，如圖1a所示，缺血再灌注組和缺血后處理組于37 ℃、0.5%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中進行糖氧剝奪12 h，參照Pignataro G等的做法［4］并加以改進，如圖1b所示缺血后處理組予以3個循環(huán)正常培養(yǎng)10 min／糖氧剝奪10 min，再正常培養(yǎng)12 h，分別于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、CCK－8試劑盒測定細胞的活力、hoechst染色于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的凋亡、Annexin－FITC和PI雙染于流式細胞儀定量分析細胞凋亡并測定細胞內SOD 活力的改變。

圖1 缺血后處理模型建立流程圖

1.2.3 CCK－8法檢測細胞的活性

經(jīng)過處理的SH－SY5Y 細胞棄培養(yǎng)基后加入提前配制的CCK－8稀釋液（CCK－8 液：DMEM／F12完全培養(yǎng)為1∶9）0.5 ml，37 ℃避光培養(yǎng)4 h用酶標儀在450 nm 測定各組細胞的吸光度（OD 值），細胞存活率%＝（實驗組吸光度－空白對照組吸光度）／（陰性對照組吸光度－空白對照組吸光度）×100%。

1.2.4 Hoechst染色觀察細胞凋亡

向處理過的SH－SY5Y 細胞培養(yǎng)基中加入Hoechst染液，混勻后37 ℃孵育20 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的凋亡。

1.2.5 Annexin V－FITC和PI雙染凋亡檢測

經(jīng)過處理的SH－SY5Y 細胞收集培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，胰酶消化細胞，與之前收集的培養(yǎng)基及PBS一起離心12000 r／m×5 min，再用PBS 洗2次，加入400μl Annexin V 結合液懸浮細胞。向細胞懸浮液中加入5μl Annexin V－FITC 染色液，混勻于4 ℃避光孵育15 min；再加入10μl PI染色液混勻于4 ℃避光孵育5 min，用流式細胞儀檢測各組SH－SY5Y 細胞的凋亡率。

1.2.6 細胞內SOD 活力的測定

各組SH－SY5Y 細胞處理后棄培養(yǎng)基，預冷的PBS洗滌2次，加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑提取蛋白，按照超氧化物歧化酶（SOD）WST－1法測定試劑盒說明書測定各組SH－SY5Y 細胞SOD 的活力，用Bradford 法測定蛋白濃度。SOD 抑制率（%）＝［（A 對照－A 對照空白）－（A 測定－A 測定空白）］／（A 對照－A 對照空白）×100% ；SOD活力（U／mgprot）＝SOD 抑制率÷50%×反應體系稀釋倍數(shù)÷待測樣本濃度（mgprot／ml）。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 SH－SY5Y 細胞形態(tài)學觀察

如圖2所示，倒置顯微鏡下觀察可見正常組細胞密集，細胞間連接緊密，軸突細長均勻；缺血再灌注組活細胞數(shù)量減少，細胞皺縮變圓，細胞間連接稀疏；缺血后處理組的活細胞較缺血再灌注組明顯增加，細胞間連接較緊密，形態(tài)較規(guī)則。

圖2 光學顯微鏡下各組SH－SY5Y 細胞形態(tài)的改變

2.2 CCK－8法測定SH－SY5Y 細胞活性

經(jīng)缺血再灌注的細胞存活率較正常組明顯下降，為（69.669±2.467）%，與缺血再灌注組相比，缺血后處理組細胞存活率有所增加，為（78.66±7.038）%。任意兩組相比均有明顯差異（P＜0.01）（圖3）。

圖3 CCK－8試劑盒測定各組SH－SY5Y 細胞存活率

2.3 Hoechst染色觀察細胞凋亡

如圖4所示，經(jīng)Hoechst染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察可見，正常組胞核染成淡藍色，缺血再灌注組較多的胞核致密濃染呈亮藍色，或呈碎塊狀致密濃染；缺血后處理組濃染的胞核較缺血再灌注組明顯減少。

2.4 Annexin V－FITC和PI雙染凋亡檢測

如圖4所示，與正常組相比，缺血再灌注組活細胞明顯減少，早期凋亡細胞和壞死細胞增加；經(jīng)缺血后處理的細胞，較缺血再灌注組的活細胞增加，早期凋亡細胞和壞死細胞減少。在流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為FITC－／PI－；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為FITC＋／PI＋；而右下象限為早期凋亡細胞，F(xiàn)ITC＋／PI－（圖5）。

圖4 熒光顯微鏡下觀察各組SH－SY5Y 細胞Hoechst染色情況

圖5 Annexin V－FITC和PI雙染檢測細胞凋亡率

2.5 SH－SY5Y 細胞內SOD 活力的測定

與正常組相比，缺血再灌注組SH－SY5Y 細胞內SOD 活力由（22.318±1.340）U／mgprot下降至（11.991±2.128）U／mgprot，下 降46.27% （P＜0.01）；與缺血再灌注相比，缺血后處理組SH－SY5Y細胞內SOD 活力由（11.991±2.128）U／mgprot上升至（15.892±4.690）U／mgprot，上升32.53%（P＜0.05）（表1）。

表1 各組SH－SY5Y 細胞SOD 活力的變化（±s，U／mgprot）

表1 各組SH－SY5Y 細胞SOD 活力的變化（±s，U／mgprot）

注：與正常組比較，△P＜0.005；與缺血再灌注組比較，＊P＜0.05

組別 SOD 活力正常組 22.318±1.340缺血再灌注組 11.991±2.128△缺血后處理組 15.892±4.690△＊

3 討 論

在缺血性腦卒中的治療中，無論是溶栓還是動脈介入治療，目的都是使閉塞的腦動脈再通，恢復梗死區(qū)的血液供應。然而，再灌注過程往往加重組織細胞功能代謝障礙及結構破壞，即再灌注損傷。缺血后處理（Ischemic postconditioning，Postcond）是新發(fā)現(xiàn)的一種機體內源性抗再灌注損傷的保護現(xiàn)象，能夠減輕再灌注后臟器損傷，與預處理相比，后處理的臨床操作簡便易行，在再灌注之前實施，時機易于掌握，可控性強，故可能具有更直接的臨床應用價值。

Zhao等通過實驗首次證實：缺血后處理組心肌梗死范圍較對照組減小44%［1］。邢變枝等通過阻塞SD 大鼠大腦中動脈60 min建立腦梗塞模型，之后給予5個循環(huán)的30 s缺血／30 s再灌注后處理，結果顯示Postcond可以減少腦梗塞面積，降低氧化應激水平，改善神經(jīng)功能評分［4，5］。Jing－ye Wang等通過阻塞大鼠頸內動脈造成全腦缺血，并給與類似的后處理，結果與局部腦缺血模型一致［6］。Pignataro等對體外培養(yǎng)神經(jīng)元實施120 min的糖氧剝奪（Oxygenglucose deprivation，OGD），制作體外缺血缺氧模型，再灌注10 min后實施10 min的OGD作為后處理措施明顯降低了細胞死亡［3］。缺血后處理對腦缺血再灌注損傷的保護效果，其機制可能與減輕再灌注后細胞凋亡、減少氧自由基的生成、刺激內源性NO 釋放、抑制炎癥有關，并參與PI3K／AKT、MAPK 等信號通路［7］，然而沒有現(xiàn)成的較合理的理論來解釋這一現(xiàn)象。

上述體內研究受多種條件的限制，結果也容易受很多因素的干擾。體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元可以使實驗結果避免很多因素的干擾，提高可信度，但原代培養(yǎng)成功率低，神經(jīng)元自然老化等原因致無法保證持續(xù)傳代。本研究通過建立SH－SY5Y 細胞缺血再灌注損傷來研究Postcond的保護作用，不僅可以控制很多因素的干擾，而且SH－SY5Y 細胞易于培養(yǎng)，增值迅速，保證研究順利進行。

本研究通過對SH－SY5Y 細胞進行糖氧剝奪后正常培養(yǎng)來模擬缺血再灌注現(xiàn)象，倒置顯微鏡下缺血再灌注組的細胞較正常組細胞生長密度明顯減少，細胞皺縮變圓，細胞間連接稀疏，經(jīng)CCK－8計數(shù)顯示存活率顯著下降（P＜0.01），Hoechst染色及流式細胞術均表明缺血再灌注組的細胞早期凋亡及壞死的比例較正常組增加，這與劉守躍［8］的研究結果一致。缺血后處理組SH－SY5Y 細胞的形態(tài)較缺血再灌注組規(guī)則，細胞生長密度有所增加，細胞間連接較緊密，CCK－8 計數(shù)顯示細胞存活率由（69.669±2.467）%上升至（78.66±7.038）%。如圖4 所示，缺血后處理組SH－SY5Y 亮藍色的胞核較缺血再灌注組少。同樣，Annexin V－FITC 和PI雙染流式細胞術分析表明缺血后處理組SH－SY5Y 早期凋亡及壞死的比例較缺血再灌注組下降。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）作為清除氧自由基的酶，比較穩(wěn)定，可間接反應氧自由基對細胞的損害程度。與缺血再灌注組相比，缺血后處理組SHSY5Y 細胞內SOD 的活力有所增加（P＜0.05）。

根據(jù)我們的實驗結果，我們認為缺血后處理對SH－SY5Y 細胞缺血再灌注損傷有一定的保護作用，細胞從形態(tài)到功能均得到不同程度的改善，這可能與抑制細胞凋亡及降低氧自由基的損傷有關。該體外模型的建立，為今后更好地研究缺血后處理的機制奠定了基礎。然而，Postcond究竟是一種“開或關”的現(xiàn)象，還是存在“量效關系”，仍需要進一步深入研究，例如增加或減少缺血／再灌注時間、循環(huán)次數(shù)研究［9］。

1 Zhao Z－Q，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（2）：H579–88.

2 Skyschally A，Caster PV，liodromitis EK，et al.Ischemic postconditioning：experimental models and protocol algorithms.Basic Res Cardiol，2009，104（5）：469－483.

3 Pignataro G，Meller R，Inoue K，et al.In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke：ischemic postconditioning.J Cereb Blood Flow Metab，2008，28（2）：232－241.

4 Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic postconditioning protects brain and reduces inflammation in a rat model of focal cerebral ischemia／reperfusion.Journal of Neurochemistry，2008，105（5）：1737－1745.

5 Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia／reperfusion injury in the rat.Stroke，2008，39（8），2362－2369.

6 Jing－ye Wang，Jia Shen，Qin Gao，et al.Ischemic Postconditioning Protects Against Global Cerebral Ischemia／Reperfusion－Induced Injury in Rats，Stroke，2008，39（3）：983－990.

7 Heng Zhao.Ischemic postconditioning as a novel avenue to protect against brain injury after stroke，J Cereb Blood Flow Metab，2009，29（5）：873－885.

8 劉守躍.OGD／R 模型誘導SH－SY5Y 細胞凋亡的蛋白組學研究，吉林大學博士學位論文，2008.

9 Zhi－Qing Zhao.Postconditioning in reperfusion injury：A status report.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24（3）：265－279.