蔡小東，李 玲，劉 敏(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北 荊州434025)

國慶1號(hào)溫州密柑愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中生理生化特性研究

蔡小東，李 玲，劉 敏(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北 荊州434025)

探討了液體懸浮培養(yǎng)不同時(shí)間的國慶1號(hào)溫州蜜柑(CitrusunshiuMarc.cv.Guoqing No.1)愈傷組織可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性還原糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性的變化。結(jié)果表明：可溶性蛋白含量在培養(yǎng)9d時(shí)達(dá)到高峰，可溶性還原糖含量在培養(yǎng)6d時(shí)達(dá)到高峰，SOD和POD活性在培養(yǎng)前期活性較低，在培養(yǎng)第9d達(dá)到高峰?？扇苄缘鞍?、可溶性還原糖含量與這2種酶的活性變化趨勢(shì)相近，由此表明在愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中，這些物質(zhì)含量或活性的變化可為確定柑橘愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)最佳繼代周期提供依據(jù)。

國慶1號(hào)溫州蜜柑(CitrusunshiuMarc.cv.Guoqing No.1)；愈傷組織；可溶性蛋白質(zhì)；可溶性還原糖；超氧化物歧化酶；過氧化物酶

植物快繁技術(shù)是生物技術(shù)中最具實(shí)用價(jià)值的領(lǐng)域之一[1]。采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快繁與育種在許多植物中已經(jīng)取得一定的成功，其中通過胚狀體發(fā)生途徑(由愈傷組織再分化形成體細(xì)胞胚狀體)是包括柑橘在內(nèi)的許多植物再生完整植株的一條有效途徑[1]。愈傷組織及其細(xì)胞懸浮系遺傳背景較一致，來源穩(wěn)定，且取材不受時(shí)間限制，可長期繼代保存，是組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體相關(guān)操作以及遺傳轉(zhuǎn)化等研究的理想起始材料。有關(guān)愈傷組織培養(yǎng)過程中相關(guān)代謝物質(zhì)前人已進(jìn)行了許多研究，植物愈傷組織培養(yǎng)以及懸浮細(xì)胞生長與代謝特征的相關(guān)研究也越來越多[2-5]。本研究通過測(cè)定國慶1號(hào)溫州蜜柑(CitrusunshiuMarccv.Guoqing No.1)愈傷組織懸浮培養(yǎng)不同時(shí)間的可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性還原糖含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性，以從生理生化層次揭示柑橘愈傷組織的生長發(fā)育特征，從而確定柑橘愈傷組織懸浮培養(yǎng)過程中繼代培養(yǎng)的最佳周期，為利用愈傷組織再生體系進(jìn)行柑橘快繁或育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

國慶1號(hào)溫州密柑愈傷組織來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組，現(xiàn)保存于長江大學(xué)楚天學(xué)者及園藝植物逆境生理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。先將轉(zhuǎn)國慶1號(hào)愈傷組織在MT固體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，再將約1g愈傷組織轉(zhuǎn)至于液體培養(yǎng)基(MT + 1.5g/L谷氨酰胺 + 0.5g/L麥芽糖提取物(Malt extrat,ME)+ 40g/L蔗糖)中，在搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，溫度為25℃的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)；分別在培養(yǎng)后0、3、6、9、12、15d取樣，以培養(yǎng)0d為對(duì)照，共6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。在培養(yǎng)過程中，每次隨機(jī)取3瓶，每次取得的材料先在液氮中迅速冷凍，再于-70℃的超低溫冰箱中保存。15d后全部材料取完再測(cè)其代謝指標(biāo)的含量，每項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 可溶性糖含量的測(cè)定

以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用蒽酮比色法[5]測(cè)定液體懸浮培養(yǎng)不同時(shí)間的愈傷組織可溶性糖含量。

1.4 可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性及POD活性的測(cè)定

分別取0.4g愈傷組織于預(yù)冷的研缽中，加入10ml預(yù)冷的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)，在冰浴下研磨成勻漿，10000r/min離心15min，取上清液用于可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性及POD活性的測(cè)定?？扇苄缘鞍缀繙y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[5]；SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[6]測(cè)定，以抑制NBT光化還原50%的酶用量為1個(gè)酶活性單位；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[6]POD活性，以1min內(nèi)光密度D470nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位。

上述各指標(biāo)測(cè)定數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件處理，以LSD法作多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白含量的變化

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間可溶性蛋白含量的變化

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間可溶性還原糖含量的變化

由圖1可以看出，國慶1號(hào)溫州蜜柑愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中，可溶性蛋白質(zhì)含量在0～3d開始增加，增加速度較快，在3～6d內(nèi)大幅度增加，并且在第9d達(dá)到最大值，9d以后逐漸下降。

2.2 可溶性還原糖含量的變化

由圖2可以看出，國慶1號(hào)溫州蜜柑愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中，可溶性還原糖含量在0～3d開始呈上升趨勢(shì)，在3～6d急劇上升，增加幅度較大；在培養(yǎng)第6d時(shí)增加到最大值，隨后又逐漸降低。

2.3 SOD活性的變化

愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中SOD活性的變化情況如圖3所示。由圖3可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，愈傷組織中SOD活性表現(xiàn)出有規(guī)律的變化，呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢(shì)。在0～3d國慶1號(hào)愈傷組織中SOD活性開始增加，增加速度較快，并保持在40～70U/g之間變動(dòng)；在6～9d增加幅度最快快，并在第9d達(dá)到高峰，隨后9～12d又逐漸下降，但仍保持較高水平?？傮w上，愈傷組織在液體懸浮培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)前期SOD性較培養(yǎng)后期活性低。

2.4 POD活性的變化

在愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中POD活性的變化情況如圖4所示。由圖4可見，在培養(yǎng)3d內(nèi)POD活性急劇下降，在第3d達(dá)到最小值；3～9d一直呈上升趨勢(shì)，增長速度較快；在第9d達(dá)到最大值，隨后P又逐漸下降，在12～15d在18～20U/g FW之間變動(dòng)，但仍保持較高水平。

3 討論

很多學(xué)者對(duì)愈傷組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究。張向前等[7]對(duì)棗樹的愈傷組織培養(yǎng)的研究表明，蛋白質(zhì)和糖是愈傷組織細(xì)胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，它們的含量變化趨勢(shì)是相同的；陳紅等[8]對(duì)刺梨花藥愈傷組織培養(yǎng)過程中生理生化特性的研究也表明這幾種代謝物質(zhì)含量的變化與愈傷組織生長的周期的曲線基本一致。一般而言，在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)懸浮培養(yǎng)體系中愈傷組織生長量有一個(gè)快速增殖期 [8-10]。本研究中，以MT為培養(yǎng)基進(jìn)行國慶1號(hào)愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)所得到的結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致[7-10]，即在國慶1號(hào)愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)過程中，可溶性蛋白與可溶性糖的變化趨勢(shì)是非常相似的；在培養(yǎng)的第0～3d，可溶性蛋白和可容性糖的含量增長不明顯，這可能是愈傷組織適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境的結(jié)果，其代謝能力較弱；第6～9d迅速增長，第9～12d以后逐漸下降，說明蛋白質(zhì)和糖正在被迅速地分解利用，從而為愈傷組織的分裂增殖提供能量，也反映出愈傷組織生長速度在這段時(shí)間內(nèi)最快；12d以后，液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分被逐漸消耗，積累的有害成分逐漸引起愈傷組織的緩慢生長，表現(xiàn)為愈傷組織褐化逐漸加重，需要及時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。POD和SOD活性的高低與植物細(xì)胞的分化發(fā)育、植物體的耐鹽性、抗熱性和抗病性等方面關(guān)系密切[11-13]。本研究中，SOD的活性含量也是處在不斷增長狀態(tài)，0～9d可溶性蛋白和可溶性糖的含量在不斷增加，SOD活性含量值也在不斷增加，而POD的活性含量在不斷下降，其中SOD以第6～9d增長的速度最快，POD在第12d后又開始上升。這說明愈傷組織的分裂和增殖需要蛋白質(zhì)和糖的快速合成，以提供物質(zhì)基礎(chǔ)。這也反映這段時(shí)間愈傷組織生長最快，到第12d后蛋白質(zhì)和糖的含量在不斷的減少后，其活性值也開始慢慢地有所下降。

在植物組織培養(yǎng)過程中常常會(huì)出現(xiàn)愈傷組織褐化、不分化或分化率低以及白化苗等問題。通過對(duì)植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物的不同發(fā)育階段保護(hù)酶活性及其相關(guān)物質(zhì)含量變化的探討，為今后選擇植物愈傷組織的最適培養(yǎng)條件提供了重要的參考依據(jù)，也為有機(jī)體的順利發(fā)育探討提供了有效手段。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間SOD活性的變化

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間POD活性的變化

[1] 霍合強(qiáng)，鄧秀新．柑桔胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、保存和利用[J]．植物生理學(xué)通訊，2000，36(2):181-187．

[2] 楊世海，劉曉峰，果德安，等．不同附加物對(duì)甘草愈傷組織培養(yǎng)中黃酮類化合物的合成[J]．中國藥學(xué)雜志，2006，41(2)：96-99．

[3] 盧文蕓，張宇斌，羅迎春，等．不同培養(yǎng)條件對(duì)環(huán)草石斛愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的影響[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(33)：16365-16368．

[4] 杜亞填，許建宇，卜曉英，等．紅豆杉植物和愈傷組織培養(yǎng)物中紫杉醇含量的檢測(cè)[J]．林產(chǎn)化工通訊，2005，39(1)：17-20 ．

[5] 何弈昆．胡蘿卜愈傷組織中苯丙氨酸解氨酶與分化關(guān)系[J]．西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1992，20(4)：169-175．

[6] 鄒 琦．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000．

[7] 王學(xué)奎．植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)(第2版)[M]．北京：高等教育出版社，2006．

[8] 張向前，陳國梁，高曉東，等．棗樹愈傷組織培養(yǎng)中幾種物質(zhì)的變化研究[J]．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14(2)：163-165．

[9] 陳 紅，張綠萍．刺梨花藥愈傷組織培養(yǎng)過程中生理生化特性研究[J]．北方園藝，2008，(8)：47-48．

[10]崔 林，范銀燕．裸燕麥胚性愈傷組織培養(yǎng)及懸浮系的建立[J]．生物工程學(xué)報(bào)，1998，14(1)：46-50．

[11] Azevedo H，Dias A，Tavaresr M R．Establishment and characterization ofPinuspinastersuspension cell cultures [J]．Plant Cel Tiss Org Cult,2008,93: 115-121.

[12] 王梓清，劉愛萍，王家福．培養(yǎng)條件對(duì)荔枝胚性愈傷組織保存中生理指標(biāo)的影響[J]．福建果樹，2008，145(2)：12-15．

[13] 吳學(xué)兵，蘇 旭，劉玉萍．青海湖畔兩種植物葉片中超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性的研究[J]．青海草業(yè)，2005，14(2)：7-11．

Q813.1

A

1673-1409(2012)06-S022-03

2012-05-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900979)。

蔡小東(1978-)，男，湖北浠水人，博士，副教授，主要從事園藝植物生物技術(shù)育種研究。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.006