澳洲長(zhǎng)鰭鰻4種同工酶的組織特異性研究

運(yùn)用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法對(duì)澳洲長(zhǎng)鰭鰻(Anguillareinhardtii)5種組織(心臟、肝臟、肌肉、眼和腎臟)的4種同工酶[酯酶(EST)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、過(guò)氧化物酶(POD)、蘋果酸脫氫酶(MDH)]進(jìn)行了研究，并對(duì)其同工酶位點(diǎn)及酶譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，澳洲長(zhǎng)鰭鰻的4種同工酶具有不同程度的組織特異性。EST檢測(cè)到16個(gè)位點(diǎn)，多個(gè)位點(diǎn)存在等位基因。G6PDH檢測(cè)到2個(gè)基因位點(diǎn)，其中1個(gè)位點(diǎn)存在等位基因。POD有3個(gè)位點(diǎn)，Pod-3檢測(cè)到2個(gè)等位基因。MDH具有s-MDH和m-MDH 2種類型，s-MDH形成2種二聚體；m-MDH形成4種二聚體。這4種同工酶在表型、分布和活性上均表現(xiàn)出明顯的組織特異性，可能與各組織執(zhí)行的生理機(jī)能相關(guān)。

澳洲長(zhǎng)鰭鰻(Anguillareinhardtii)；同工酶；組織特異性

中國(guó)鰻魚養(yǎng)殖以歐洲鰻鱺和日本鰻鱺為主，總產(chǎn)量居世界第一，約占世界總產(chǎn)量的70%。世界各國(guó)養(yǎng)殖的鰻魚苗種只能依靠近海的天然鰻苗資源，目前日本鰻鱺和歐洲鰻鱺苗種捕撈資源嚴(yán)重不足，無(wú)法滿足現(xiàn)有養(yǎng)殖規(guī)模[1-3]。澳洲長(zhǎng)鰭鰻(Anguillareinhardtis，英文名Australian longfin eel)隸屬鰻鱺科鰻鱺屬，產(chǎn)于澳大利亞?wèn)|南部、洛德豪島、新喀里多尼亞。因其形體大，俗稱長(zhǎng)鰭鰻、龍?chǎng)?。該品種生長(zhǎng)速度快、性情溫和、易于飼養(yǎng)、味道鮮美，是一種名貴鰻魚，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)已有少數(shù)單位進(jìn)行養(yǎng)殖和開(kāi)發(fā)，具有良好的養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)前景。如能進(jìn)行推廣，可緩解當(dāng)前日本鰻鱺和歐洲鰻鱺苗種不足的情況。目前對(duì)澳洲長(zhǎng)鰭鰻的研究很少，本研究采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法探討了澳洲長(zhǎng)鰭鰻4種同工酶在5種組織中的分布、類型、活性等，以期為澳洲長(zhǎng)鰭鰻的種質(zhì)資源鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)分析提供有價(jià)值的生化指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚取自山東省淡水水產(chǎn)研究所，體長(zhǎng)25～45cm，體重376～928g。

1.2 樣品制備

取試驗(yàn)用魚共30尾，剪斷尾動(dòng)脈和鰓，在流水中放血以減少組織帶血，然后迅速摘取眼睛、心臟、腎臟、肝臟、肌肉等組織，用預(yù)冷的0.8%生理鹽水將各組織沖洗干凈，取適量稱重，放入預(yù)冷的研缽中，用消毒的剪刀剪碎，加入預(yù)冷的0.01mol/L的pH7.4的磷酸緩沖液(組織∶緩沖液=1g∶3ml)，冰浴中研磨，研磨成漿后置4℃抽提1～2h，4℃15000r/min離心30min，取上清液，加入等體積的40%的蔗糖溶液，分裝，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 電泳及染色

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法，分離膠濃度(T)為7.0%或7.5%，濃縮膠濃度為4%或3%。電泳緩沖液為Tris-Gly，高離子強(qiáng)度電泳緩沖液(pH8.3)或低離子強(qiáng)度電泳緩沖液(pH8.7)。梯度膠的濃度和緩沖系統(tǒng)見(jiàn)表1，點(diǎn)樣量為20μl，以溴酚藍(lán)作指示劑，電泳在4℃冰箱進(jìn)行。同工酶的染色方法參照文獻(xiàn)[4-7]稍作改進(jìn)。同工酶的命名和分析參照文獻(xiàn)[7-8]，以各酶帶的相對(duì)遷移率(Rf)從小到大依次命名，即向陽(yáng)極泳動(dòng)最快的編為1號(hào)，依次順序編為2、3、4、…，同一基因位點(diǎn)的不同等位基因按照從陰極到陽(yáng)極的順序依次標(biāo)記為a、b、c、…。

對(duì)澳洲長(zhǎng)鰭鰻5種組織的4種酶類進(jìn)行多次電泳，篩選出酶譜清晰的結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 用于分析澳洲長(zhǎng)鰭鰻同工酶的名稱、編號(hào)、緩沖系統(tǒng)和凝膠濃度

注：TG8.3指Tris-甘氨酸高離子強(qiáng)度電泳緩沖液(pH8.3)；TG8.7指Tris-甘氨酸低離子強(qiáng)度電泳緩沖液(pH8.7)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶(EST)

L:肝臟(liver)；H:心臟(heart)；K:腎臟(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

魚類的酯酶較復(fù)雜，一般認(rèn)為是單體酶或多聚體酶，由多個(gè)基因位點(diǎn)編碼[9]，多態(tài)現(xiàn)象非常普遍[7]。從澳洲長(zhǎng)鰭鰻不同組織的EST電泳圖譜(圖1)可以看出，EST在澳洲長(zhǎng)鰭鰻的心臟、肝臟、肌肉、眼和腎臟中都有分布，共有16個(gè)位點(diǎn)；肝臟和腎臟EST表達(dá)豐富，肝臟有12條酶帶，腎臟有13條酶帶，心臟和眼中表達(dá)次之，心臟8條酶帶，眼中7條酶帶，肌肉中表達(dá)最弱，有7條酶帶。Est-9和Est-10這2個(gè)位點(diǎn)在5種組織中都表達(dá)，且都有2個(gè)等位基因，Est-6在肝臟中有2種基因型aa、bb，在腎臟中只有1種基因型aa。

2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)

G6PDH為二聚體酶[10]，由G6pdh-1、G6pdh-2這2個(gè)基因座位編碼。澳洲長(zhǎng)鰭鰻的G6PDH在肝臟和腎臟中表達(dá)，G6pdh-1在肝臟表達(dá)很弱，腎臟表達(dá)較明顯，且表現(xiàn)出2種基因型，G6pdh-2在肝臟表達(dá)量較大，腎臟表達(dá)很弱(圖2)，組織差異性顯著。

L:肝臟(liver)；H:心臟(heart)；S:脾臟(spleen)；K:腎臟(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

2.3 過(guò)氧化物酶(POD)

POD是一類清除細(xì)胞內(nèi)H2O2的同工酶，具體為幾聚體還未有定論，有學(xué)者認(rèn)為是二聚體酶[9,11]。澳洲長(zhǎng)鰭鰻的POD有3個(gè)位點(diǎn)，分別為Pod-1、Pod-2、Pod-3，其中Pod-1和Pod-2只在心臟中表達(dá)，Pod-3在5個(gè)組織中都表達(dá)，有2個(gè)等位基因(圖3)。

2.4 蘋果酸脫氫酶(MDH)

硬骨魚的蘋果酸脫氫酶為二聚體，存在有相互不形成異聚體的上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)2部分，均是由2基因編碼的二聚體[12]。澳洲長(zhǎng)鰭鰻的MDH也具有s-MDH和m-MDH 2種類型(圖4)，s-MDH形成2種二聚體，s-Mdh1在心臟和腎臟中表達(dá)，s-Mdh2在心臟和肌肉中表達(dá)；m-MDH形成4種二聚體，m-Mdh1僅在肝臟中表達(dá)，m-Mdh2在心臟和肝臟中表達(dá)，m-Mdh3在心臟、肝臟、眼、腎臟中都表達(dá)，m-Mdh4僅在眼中表達(dá)，澳洲長(zhǎng)鰭鰻的MDH在不同組織中的表達(dá)差異顯著。

L:肝臟(liver)；H:心臟(heart)；K:腎臟(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

L:肝臟(liver)；H:心臟(heart)；K:腎臟(kidney)；M:肌肉(muscle)；E:眼睛(eye)

3 討論

3.1澳洲長(zhǎng)鰭鰻不同組織同工酶表達(dá)的特異性及其與功能的關(guān)系

EST屬于水解酶類，能催化酯鍵水解，對(duì)于脂類代謝和生物膜的結(jié)構(gòu)與功能具有一定作用[13]。一般認(rèn)為在硬骨魚類中EST是單體或二聚體，由多個(gè)位點(diǎn)編碼，多態(tài)現(xiàn)象非常普遍。澳洲長(zhǎng)鰭鰻腎臟和肝臟中EST的含量比較豐富，這和赤點(diǎn)石斑魚、暗紋東方鲀、青海湖裸鯉等魚類的EST表達(dá)類似[9,14-15]，可能與肝、腎組織脂類代謝和機(jī)體的解毒作用密切相關(guān)。同時(shí)，從澳洲長(zhǎng)鰭鰻EST的表達(dá)酶譜上看，與其他已報(bào)道的魚類相比，澳洲長(zhǎng)鰭鰻EST表達(dá)量大，且酶帶很多，這可能與澳洲長(zhǎng)鰭鰻體內(nèi)脂肪含量豐富、脂類代謝旺盛相關(guān)。龍華等[16]曾報(bào)導(dǎo)過(guò)歐洲鰻和日本鰻肝臟、心臟和肌肉中的EST酶譜；與澳洲長(zhǎng)鰭鰻相比，歐洲鰻和日本鰻這3種組織中的EST表達(dá)不及澳洲長(zhǎng)鰭鰻EST表達(dá)豐富，3種鰻魚的EST表達(dá)有顯著區(qū)別，因此，肝臟、心臟的EST表達(dá)酶譜可用于鑒別澳洲長(zhǎng)鰭鰻、歐洲鰻和日本鰻。

隨著科技的迅猛發(fā)展和科技產(chǎn)品在生活領(lǐng)域的深入,一些新興的“科技疾病”已經(jīng)悄然出現(xiàn)在疾病譜之中。如:夏季的“空調(diào)病”,智能手機(jī)所帶來(lái)的“手機(jī)拇指病”等。近年來(lái),“加濕性肺炎”這個(gè)新興的科技疾病走入了人們的視線,“加濕性肺炎”并非專業(yè)醫(yī)學(xué)名詞,也并非單指肺炎,與加濕器也無(wú)必然聯(lián)系,而是因加濕器使用不當(dāng)造成的呼吸道系統(tǒng)的一系列疾病。包括上呼吸道感染、支氣管炎、哮喘、肺炎等。孕、產(chǎn)婦是一特殊群體,在現(xiàn)今社會(huì)受到了家屬的“盲目關(guān)心”,而家屬醫(yī)學(xué)知識(shí)的匱乏或不良的使用方式,可能在無(wú)意中損害了孕婦的身體健康。

G6PDH為二聚體酶，是糖代謝中磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，該途徑產(chǎn)生的NAPDH能被細(xì)胞廣泛用來(lái)驅(qū)使還原性厭氧途徑，為生物合成提供動(dòng)力，如脂肪酸、固醇類物質(zhì)的合成等，產(chǎn)生的磷酸戊糖參與核酸代謝[17]。澳洲長(zhǎng)鰭鰻的G6PDH在肝臟和腎臟中表達(dá)，肝臟中G6pdh-2表達(dá)量較大，腎臟中G6PDH表達(dá)很弱，但G6pdh-1表現(xiàn)出多態(tài)性，其他組織未見(jiàn)表達(dá)或表達(dá)太弱，現(xiàn)使用的檢測(cè)方法無(wú)法檢出，澳洲長(zhǎng)鰭鰻G6PDH的表達(dá)組織差異性顯著。澳洲長(zhǎng)鰭鰻G6PDH的表達(dá)情況與與已報(bào)道的鱸魚、虹鱒等魚類表達(dá)類似[10,12]，都是肝臟中活性最強(qiáng)，這應(yīng)與肝臟的功能密切相關(guān)。

POD是一類清除細(xì)胞內(nèi)H2O2的同工酶，其主要功能是清除氨基酸分解代謝及糖醛酸合成代謝等過(guò)程中形成的過(guò)氧化物。動(dòng)物的甲狀腺細(xì)胞、具有吞噬功能的白細(xì)胞等含有豐富的過(guò)氧化物酶，因此在血流豐富、白細(xì)胞及吞噬細(xì)胞含量較多的心臟、肝臟、腎臟中同工酶POD的表達(dá)較強(qiáng)，而肌肉中表達(dá)較弱或無(wú)表達(dá)[9]。澳洲長(zhǎng)鰭鰻的POD由3個(gè)基因座位編碼，心臟中表達(dá)最為強(qiáng)烈且Pod-1、Pod-2、Pod-3都有表達(dá)，腎臟中POD活性也比較強(qiáng)，Pod-3在各種組織中均存在，可能在細(xì)胞中執(zhí)行最基本的功能。澳洲長(zhǎng)鰭鰻的POD表達(dá)和已報(bào)導(dǎo)的暗紋東方鲀的POD表達(dá)[18]很類似。

MDH是糖代謝三羧酸循環(huán)過(guò)程中的重要酶類，在細(xì)胞中的功能主要是使蘋果酸脫氫參與糖酵解后的有氧代謝[19]。因此，MDH在心臟、肝臟等有氧代謝旺盛的組織中染色較深。從圖4可知，澳洲長(zhǎng)鰭鰻肝臟和心臟中POD活性較強(qiáng)，腎臟次之，肌肉和眼中活性較弱，這與肝臟和腎臟有氧代謝旺盛密切相關(guān)。

3.2 澳洲長(zhǎng)鰭鰻同工酶的表達(dá)具有明顯的組織特異性

綜上所述，通過(guò)澳洲長(zhǎng)鰭鰻的4種同工酶研究可以看出，澳洲長(zhǎng)鰭鰻這4種同工酶的表達(dá)在不同組織間差異性顯著，且這種表達(dá)上的特異性是與各組織的功能相一致的；同時(shí)，通過(guò)與已報(bào)導(dǎo)的日本鰻和歐洲鰻同工酶譜比較，發(fā)現(xiàn)肝臟、心臟的EST表達(dá)酶譜可用于鑒別澳洲長(zhǎng)鰭鰻、歐洲鰻和日本鰻。

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Q55;Q959.46+9

A

1673-1409(2012)06-S014-04

2012-04-10

山東省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2009GG2GG09027)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目；水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)項(xiàng)目。

李 嫻(1979-)，女，安徽蚌埠人，碩士，助理研究員，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種研究。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.004