劉迎春,聶惠蓉(福建醫(yī)科大學細胞生物學與遺傳學系，福建 福州 350004)

李裕紅(泉州師范學院生物系,福建 泉州 362000)

東亞飛蝗TLR9基因cDNA克隆及蛋白質序列分析

劉迎春,聶惠蓉(福建醫(yī)科大學細胞生物學與遺傳學系，福建 福州 350004)

李裕紅(泉州師范學院生物系,福建 泉州 362000)

東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)依靠先天性免疫系統(tǒng)來防御病原微生物的入侵，TLRs是天然免疫重要的病原體識別受體。在已知的東亞飛蝗TLR9受體基因(LmTLR9) 的cDNA部分序列基礎上，進一步獲得其序列并對其序列進行分析；觀察金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) 的侵染對蝗蟲LmTLR9 mRNA 表達的影響。結果表明獲得的LmTLR9 cDNA序列含有1個2340bp的開放閱讀框,推定的蛋白質序列由780個氨基酸殘基組成。與黑腹果蠅、岡比亞按蚊和致倦庫蚊的氨基酸序列同源性分別為19.0%、26.0%和26.0%；與對照組相比,侵染綠僵菌24h和48h后，試驗組東亞飛蝗中腸TLR9 mRNA 分別升高了7.17 %和4.97 %,但無顯著性差異。

東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis);Toll 樣受體9基因；序列分析

飛蝗是一種洲際性農業(yè)重大害蟲，東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)在我國分布面積廣，危害最為嚴重。因而加強對飛蝗等農業(yè)害蟲的研究和災害的綜合防治，已成為關系我國經濟發(fā)展和社會穩(wěn)定的重要因素。目前，由于化學農藥的種種弊端,利用生物殺蟲農藥控制蝗蟲已得到廣泛認同。然而蝗蟲的免疫防御作用極大地延緩了生物殺蟲劑的殺蟲速率?；认x沒有類似于T細胞和B細胞的專一獲得性免疫系統(tǒng)，先天免疫系統(tǒng)是其唯一的防御系統(tǒng)[1]。天然免疫系統(tǒng)主要分為2大類：體液免疫和細胞免疫。其中由昆蟲脂肪體合成分泌抗菌肽形成的昆蟲體液免疫最快。抗菌肽的合成由2條不同的信號通道調節(jié)：Toll信號途徑和Imd信號途徑[2]。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs) 是參與Toll途徑的主要基因產物，是一組與天然免疫密切相關、進化保守的受體家族。TLRs通過參與對不同病原體的PAMPs (Pathogen associated molecular pattern)進行識別，并將胞外識別信號傳遞到胞內，這是啟動先天免疫所必需的[3]。Toll蛋白最早是在研究果蠅胚胎發(fā)育中背腹極性形成時被發(fā)現的，后又發(fā)現Toll蛋白與免疫應答的關系。隨后在人類和其他動物中也有發(fā)現大量的Toll及同源蛋白，被稱為Toll樣受體(TLR)。研究表明，Toll樣受體同源分子都是Ⅰ型跨膜蛋白，它由緊密相連的3個部分組成： 胞外段是富含18～31個亮氨酸重復序列(Leucine rich repeats，LRRs)，參與對入侵病菌的PAMPs( Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)識別；跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的結構域；胞內段與IL-1受體(Interleukin-1 receptor IL-1R)同源[3]。迄今,在果蠅中已有12種Toll受體被鑒定，在岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)、家蠶(Bombyxmori)和蜜蜂(Apismellifera)也分別有11、11和5種Toll樣受體被鑒定[4-7]。這些受體對激活宿主昆蟲的先天性免疫應答起著十分重要的作用， 然而，目前對于蝗蟲Toll樣受體的報道,僅限于獲得部分TLR9的cDNA片段[8]。金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) 是一類應用廣泛的昆蟲病原真菌,在蝗蟲防治中起著重要作用[9]。目前已有報道在正常東亞飛蝗的中腸中檢測到了TLR9基因的明顯表達，但真菌的侵染是否對東亞飛蝗TLR9的表達有影響,但影響如何目前尚未見報道。為此,本研究通過已獲得的cDNA片段進一步克隆蝗蟲TLR9基因,用生物信息學方法進行了分析，并利用實時定量PCR方法研究該基因在綠僵菌侵染蝗蟲后的表達量的變化,為進一步研究蝗蟲TLR9受體在先天性免疫的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株和質粒

東亞飛蝗參照Gillespie等[10]的方法進行人工飼養(yǎng)：飼養(yǎng)溫度30℃,相對濕度75%,光照時間12h/d；大腸桿菌JM 109 購自博大派克公司；金龜子綠僵菌菌株購自上海復祥生物科技有限公司；質粒pMD18-T購自寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑

Prime STARTMDNA Polymerase、SmartTMPCR cDNA Synthesis Kit為CLONTECH 公司產品； 限制性內切酶、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)、T4多核苷酸激酶(T4PNK) 和mRNA提取試劑盒購自Promega公司；High Pure Plasmid Isolation Kit 為Roche公司產品； 凝膠回收試劑盒為博亞生物技術有限公司產品； 其余試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.2 引物設計

為獲得LmTLR9基因cDNA的5’ 端序列,采用SMART 5’-RACE 法,根據已知的cDNA片段序列設計嵌套式PCR引物T93、T94和T95。反轉錄引物T93為5’-AGGTCTTCTACTTGT-3’； 引物T94為5’-GCGCAGTCTCTTCAAGAA-3’； 引物T95為 5’-AATTGTCCAGACACCGATA -3’。

1.3 LmTLR9基因5’ 端cDNA 序列的克隆

取東亞飛蝗成蟲中腸液氮研磨至粉末狀,mRNA提取按試劑盒說明書進行。根據Genbank上已知的東亞飛蝗TLR9的部分cDNA序列(1230bp，含3’polyA),設計1條反轉錄引物T93和1對嵌套式PCR引物T94、T95,以東亞飛蝗mRNA 500ng為模板,按照5’-Full RACECore Set 描述的操作程序進行,首先以T93為反轉錄引物合成第一鏈cDNA,然后以其為模板,利用該試劑盒提供的5’PCR PrimerⅡA 和下游特異引物T94、T95,PCR 擴增出TLR9基因5’ 端cDNA 序列,然后將回收純化后的PCR產物經PCR在3’ 端加A,并將產物連接到pMD218T Vector上。按文獻采用氯化鈣法制備大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞,進行連接、轉化、陽性克隆菌株的篩選及電泳鑒定?？寺【暧缮虾angon公司進行DNA序列測定,將獲得的序列和已知的3’端cDNA序列拼接得到LmTLR9序列，并進行分析。

1.4 序列分析

用ORF Finder 軟件對克隆片段進行翻譯,用Multalin軟件進行同源性分析,用SOSUI WWW Server預測該氨基酸序列是否屬于膜蛋白。用SMART軟件分析氨基酸序列的結構功能域，用SOPMA 程序預測其二級結構。

1.5 熒光定量PCR 檢測

取東亞飛蝗成蟲初期雄蟲，在其前胸背板用微量進樣器接種含1.0×105個綠僵菌孢子的棉籽油5μl，分別于接種后0、24、48h提取東亞飛蝗的中腸的總RNA。根據東亞飛蝗TLR9和NADH的序列設計引物T9F 5’-GGAAGATT GTGGTCATTGTAG -3’；T9R 5’-ACCACTGACTGCGAAGA -3’； NADH F 5’- T CCACCAAAGACAGCAAC- 3’ ；NADH R 5’-T ATTCGT TTATGGGTTC 3’ 。以NADH為內參照。引物合成和測序由上海生物工程公司完成。熒光定量PCR 反應體系如下：10× PCR Buffer 2.5μl，10mmol/L dNTP 0.5μl，上、下游引物各0.5μl (10pmol/L)，模板cDNA 1.5μl，Taq 酶0.2μl(50U/μl)，10×SYBR Green Ⅰ 2.5μl,加去離子水至25μl。每個樣本設3 個反應，反應條件為：94℃ 4 min；94℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 30s，共40個循環(huán)。熒光定量PCR 結果以Ct值表示，Ct值為每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數。ΔCt值為基因的平均Ct值減去內標基因NADH的Ct值；ΔΔCt值為不同時間樣品的ΔCt的差值；2-ΔΔCt為基因差異表達的倍數。

2 結果與分析

2.1 序列解析

圖1 東亞飛蝗TLR9結構預測圖

通過RT-PCR 和5’RACE方法克隆的東亞飛蝗TLR9基因cDNA部分序列( GenBank登錄號：JQ910652,縮寫名為LmTLR9),序列長度為2632bp。用ORF Finder對cDNA序列進行分析,該序列含有一個長2340bp的開放閱讀框,由該序列推定的蛋白質序列由780個氨基酸殘基組成。SOSUI軟件預測東亞飛蝗TLR9受體是一個跨膜蛋白受體。根據SMART程序分析LmTLR9的氨基酸序列,LmTLR9是個3次跨膜蛋白( 圖1)，由胞外區(qū)、3個跨膜區(qū)(212～229aa，456～478aa,565～587aa)和胞內區(qū)3部分組成。其胞外結構域由多個串聯(lián)重復的LRR序列組成，而胞內區(qū)含有與人白細胞介素1受體(IL-1R)高度同源的區(qū)域即TOLL/IL-1受體同源(TIR)，說明LmTLR9分子具有病原分子模式識別和信號傳導的作用。SOPMA 程序預測其二級結構：α 螺旋(Alpha Helix)占37.56 %，β 轉角(Beta turn)占6.28 %，20.26%的延伸鏈(Extended strand)，無規(guī)則卷曲(Random coil)占35.90% (圖2)。

圖2 東亞飛蝗TLR9二級結構預測圖

圖3 東亞飛蝗TLR9 基因產物氨基酸序列同源性預測

2.2 東亞飛蝗TLR9氨基酸序列的同源性分析

推導氨基酸序列比較結果表明，東亞飛蝗TLR9與黑腹果蠅(登錄號NP-649214)、岡比亞按蚊(登錄號AAL37903)和致倦庫蚊(登錄號EDS27864)的TLR9 分子同源性分別為19.0%、26.0%和26.0%。通過分析發(fā)現，東亞飛蝗TLR9蛋白同其他昆蟲的TLR9蛋白在受體同源區(qū)(TIR)具有較高的同源性，其他區(qū)域的同源性極低( 圖3)，表明TLR9在進化過程中保守性低。

2.3 東亞飛蝗TLR9基因的表達

熒光定量RT-PCR 方法檢測LmTLR9基因在東亞飛蝗被綠僵菌侵染0、24、48h的表達水平，結果表明侵染綠僵菌24、48h的LmTLR9基因表達量分別為對照組的107.17%和104.97%，但差異不顯著(Pgt;0.05)，無統(tǒng)計學意義(表1)。這表明LmTLR9基因的表達量在侵染前后沒有發(fā)生顯著變化。

表1 東亞飛蝗TLR9基因的表達情況

3 討論

生物農藥是未來農藥發(fā)展的趨勢,蝗蟲的免疫防御反應極大地延緩了目前使用的微生物殺蟲劑的殺蟲效率,因此,研究蝗蟲免疫應答機制,找到免疫應答過程中的關鍵因子并以此為靶標,篩選對這個關鍵因子有抑制、阻斷等功能的基因,對于高效殺蟲生物的篩選、改良和設計具有十分重要的應用價值。金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae) 是一類應用廣泛的昆蟲病原真菌,在蝗蟲防治中起著重要。在昆蟲中,對PAMPs的識別是由Toll受體介導的[3]。目前已發(fā)現的TLR家族成員至少有10種,均參與機體的固有免疫反應。有研究表明，TLRs中以TLR2、TLR4和TLR9在抗真菌感染免疫的作用最為重要[11-14]，例如,TLR2和TLR4可識別白念珠菌和煙曲菌,TLR9也可識別煙曲菌。

本研究采用RACE等手段,分離出了東亞飛蝗TLR9基因cDNA 序列,NCBI的GenBank 登錄號為JQ910652(cDNA序列)。將LmTLR9 cDNA 序列用NCBI Blastn 工具與數據庫進行比對，除其TIR部位，其他序列同源性很低。目前昆蟲TLR9的氨基酸序列已在果蠅和蚊子中被分離鑒定出來，東亞飛蝗TLR9推導氨基酸序列與上述昆蟲蛋白氨基酸序列同源性變動在19%～26% 之間，同源性主要表現在受體同源區(qū)(TIR)。蛋白分子結構預測結果表明，LmTLR9是跨膜蛋白，胞外區(qū)具有LRR結構域，胞內區(qū)具有TIR結構域，表現出典型的TLR家族結構特征，表明東亞飛蝗TLR9分子具有病原分子模式識別和信號傳導的作用。本研究驗證了TLR9在正常東亞飛蝗中腸組織中有表達,推測這可能與中腸內存在大量的腸道微生物菌群有關。在侵染綠僵菌24h和48h,LmTLR9 mRNA表達量沒有顯著變化,現已明了TLR9主要識別細菌的CpG,它是細菌DNA中以未甲基化的CpG二核苷酸為核心的特定寡核苷酸序列。筆者分析TLR9可能未能識別綠僵菌的CpG，因此沒有參與綠僵菌入侵的信號轉導。目前東亞飛蝗其他的TLRs仍未見報道。可以相信,隨著對東亞飛蝗TLRs的研究逐漸深入,一定能對蝗蟲的防治提供詳盡理論基礎和技術儲備。

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Q78

A

1673-1409(2012)06-S018-04

2012-06-10

福建省自然科學基金項目(2009J05068)；福建醫(yī)科大學博士啟動基金項目(2009BS002)

劉迎春(1974-)，女，福建福鼎人，博士，副教授，研究方向為生物醫(yī)學工程。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.06.005