金其貫 劉霞 李濤

揚州大學(xué)體育學(xué)院（揚州 225009）

糖尿病心肌病 （diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病主要的心血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高，危害性大，與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率和高病死率密切相關(guān)［1，2］。 糖尿病時，心肌細胞能量代謝紊亂和功能改變，促使心肌纖維化的一些細胞因子和炎癥因子異常表達，從多方面損害心肌細胞，引起心室重構(gòu)。有研究認(rèn)為糖尿病心肌細胞凋亡的發(fā)生與心肌功能下降有密切的聯(lián)系，可能是DCM發(fā)生的重要誘因［3-5］。有氧運動鍛煉、膳食控制和藥物是治療糖尿病的“三駕馬車”，有關(guān)有氧運動鍛煉和膳食控制治療糖尿病的研究大多集中在有氧運動鍛煉或膳食控制能否有效改善糖尿病患者糖脂代謝異常及其可能機制，而探討有氧運動鍛煉或膳食控制對糖尿病心肌細胞凋亡的干預(yù)作用及其機制并不多，特別是有氧運動和膳食控制對糖尿病心肌細胞凋亡的交互作用的研究尚未見報道。因此，本研究通過高脂高糖膳食和小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）注射建立 2型糖尿病 （type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型，對糖尿病大鼠分別進行有氧運動鍛煉或膳食控制以及有氧運動鍛煉聯(lián)合膳食控制等干預(yù)措施，檢測心肌細胞凋亡和心肌組織Bcl-2和Fas含量，研究有氧運動鍛煉或膳食控制對糖尿病心肌細胞凋亡的干預(yù)作用及其機制，為進一步研究有氧運動、膳食控制干預(yù)DCM的發(fā)生和發(fā)展提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選用清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠62只，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司 ［生產(chǎn)許可證號 SCXK（滬）2007-0005，合格證號 0045386］，6 周齡，體重160～200 g，分籠飼養(yǎng)，每籠4只，飼養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時間12 h左右，每天更換一次墊料，保持籠內(nèi)干燥。

隨機抽取8只大鼠作為正常對照組 （C組），喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料。其余54只喂飼高脂髙糖飼料。7周后，禁食10 h，按30 mg/kg體重的劑量腹腔注射1%溶液STZ（將STZ溶于 0.1 mol/L，pH為4.4檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液中配成1%的溶液，使用前臨時配制）。注射7天后，空腹尾靜脈采血，用快速血糖儀測定大鼠空腹血糖（FPG），以FPG≥7.8 mmol/L作為T2DM大鼠的入選依據(jù)，共有39只大鼠建模成功。然后將T2DM大鼠隨機分成DM對照組 （DM組，n=9）、DM+運動鍛煉組（DME 組，n=10）、DM+膳食控制組（DMD組，n=10）和DM+運動鍛煉+膳食控制組（DMED組，n=10）4組。本實驗在揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心實驗室完成。

1.2 實驗方案

C組：國家標(biāo)準(zhǔn)齒類飼料飼養(yǎng)，不進行游泳運動鍛煉。DM組：喂飼高脂高糖飼料，不進行運動鍛煉。DME組：喂飼高脂高糖飼料，每天下午進行一次60 min無負(fù)重游泳運動，每周運動6天。第1周進行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，第1天運動時間為15 min，以后每天遞增10～20 min，1周后增至每天60 min，以后每周維持此運動量，持續(xù)運動12周。DMD組：喂飼與DM組等量的標(biāo)準(zhǔn)飼料，不進行運動鍛煉。DMED組：喂飼與DM組等量的標(biāo)準(zhǔn)飼料，按照DME組運動方案進行鍛煉。運動時注意大鼠狀態(tài)，防止溺水死亡，及時撈出大鼠糞便，保持游泳池水清潔。

游泳池為100 cm×70 cm×60 cm的長方體，水深50 cm，水溫（32±1）℃。高脂高糖飼料按照66.5%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、2.5%膽固醇、1%豬膽鹽和20%蔗糖的配方由南京安立默生物科技公司加工制作。每天分2次定時喂食，實驗過程中由于操作不當(dāng)，DMED組和DMD組分別有2只和3只大鼠死亡。

1.3 取材

動物在末次運動鍛煉結(jié)束后，禁食12 h，第2天依次按50 mg/kg的劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉，然后從腹主動脈取血5 ml，注入無菌玻璃試管中，在1 h內(nèi)，4℃、4000 r/min離心10 min后，分離血清，在2 h內(nèi)測定FPG。同時，在心尖部取心室肌，立即分成兩塊，一塊放入10%甲醛溶液中固定，制備石蠟切片，觀察心肌細胞凋亡；另一塊用錫箔紙包裹后立即放入液氮中保存。準(zhǔn)確稱量0.3 g心室肌，剪碎后移入玻璃勻漿器，加入預(yù)冷的生理鹽水使總體積至3 ml，在冰浴下仔細研磨，將勻漿液3500 r/min、4℃離心 10 min，取上清液-40℃保存，測定心肌組織Bcl-2和Fas含量。

1.4 指標(biāo)測定

采用葡萄糖氧化酶法測定FPG，儀器為日立全自動生化分析儀。將心肌組織常規(guī)包埋制作成石蠟切片，采用TUNNEL法檢測心肌細胞凋亡，試劑盒購于南京凱基生物發(fā)展有限公司。在高倍顯微鏡下觀察心肌細胞核染色情況，每個標(biāo)本隨機選取7個高倍視野（400×），分別計數(shù)凋亡細胞核（棕黃色），正常細胞核（藍色）和總細胞核（凋亡細胞核+正常細胞核），以凋亡細胞核與總細胞核比值作為凋亡指數(shù)。采用Elisa法測定心肌組織Bcl-2和Fas含量，采用美國 ADL（Adlitteram Diagnostic laboratories）試劑盒，測定儀器為ELX800型酶標(biāo)儀。采用考馬斯亮藍法測定心肌勻漿液總蛋白含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，測試儀器為UV-2450分光光度計。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用雙因素方差分析和獨立樣本t檢驗，P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 FPG和心肌細胞凋亡指數(shù)

由表1可見，T2DM大鼠模型建立后第13周，DM組大鼠FPG和心肌細胞的凋亡指數(shù)均顯著高于C組（P<0.01）。通過雙因素方差分析可知，有氧運動降低T2DM大鼠FPG水平（P<0.05）和心肌細胞凋亡指數(shù)（P<0.01），而膳食控制未降低T2DM大鼠FPG水平（P>0.05），但顯著降低心肌細胞凋亡指數(shù)（P<0.01）；有氧運動聯(lián)合膳食控制對降低T2DM大鼠FPG水平無顯著交互作用（P>0.05），但對降低心肌細胞凋亡指數(shù)有顯著的交互作用（P<0.01）。

表1 各組大鼠FPG和心肌細胞的凋亡指數(shù)比較

2.2心肌組織Bcl-2和Fas含量

表2顯示，T2DM大鼠模型建立后第13周，DM組大鼠心肌組織中Bcl-2含量顯著低于C組 （P<0.05），F(xiàn)as含量顯著高于 C 組（P<0.01）。通過雙因素方差分析可知，有氧運動鍛煉或膳食控制可升高心肌組織Bcl-2含量，但均無統(tǒng)計學(xué)意義，同時顯著降低心肌組織Fas含量（P<0.01）；而有氧運動聯(lián)合膳食控制對2型糖尿病大鼠心肌組織Bcl-2含量和Fas含量有顯著交互作用，升高心肌組織Bcl-2含量、降低 Fas含量（P<0.01）。

表2 各組大鼠心肌組織Bcl-2和Fas含量比較

3 討論

3.1 糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的情況及有氧運動和膳食控制的干預(yù)作用

不少研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病機體心肌細胞凋亡增加。Fiordaliso 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠早期（3天）存在心肌細胞凋亡，認(rèn)為心肌細胞凋亡與糖尿病心肌肥厚及心力衰竭有關(guān)。符麗娟等［7］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠模型成功建立后8周，心肌細胞凋亡數(shù)量顯著多于正常大鼠。Backlund等［8］的實驗結(jié)果表明，12周時糖尿病大鼠已出現(xiàn)心肌肥厚、心臟舒縮功能異常并逐漸加重，此時心肌凋亡細胞數(shù)目明顯增加，24周時心肌細胞凋亡有進一步增加的趨勢，從而認(rèn)為細胞凋亡是糖尿病大鼠心室重塑及心臟功能下降的重要因素。也有學(xué)者進一步研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌細胞凋亡隨病程延長呈逐漸上升趨勢［9］。 但劉欣等［10］研究不同病程 2 型糖尿病大鼠心肌細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，造模成功4周后，糖尿病大鼠心肌細胞凋亡率明顯上升，并達到峰值；隨病程延長，心肌細胞凋亡率維持較高水平，但比造模成功4周時略有下降。本研究結(jié)果顯示，DM組大鼠FPG含量和心肌細胞凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組，表明糖尿病機體心肌細胞凋亡數(shù)量顯著增加。

有氧運動和膳食控制是治療糖尿病的重要手段，但有氧運動和膳食控制干預(yù)糖尿病心肌細胞凋亡的相關(guān)研究較少。金怡等［11］通過TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)進行低強度運動的糖尿病大鼠心肌細胞凋亡顯著減少，認(rèn)為低強度有氧運動對減少糖尿病大鼠心肌細胞凋亡有積極意義。王寧等［12］發(fā)現(xiàn)，低脂飲食可減少糖尿病心肌細胞凋亡。本研究采用交互設(shè)計方案，在成功建立2型糖尿病大鼠模型后，采用12周有氧運動、膳食控制和有氧運動聯(lián)合膳食控制進行干預(yù)。采用雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，長期有氧運動顯著降低T2DM大鼠FPG水平和心肌細胞凋亡指數(shù)，而膳食控制對降低T2DM大鼠FPG水平無明顯影響，但可顯著降低心肌細胞凋亡指數(shù)；有氧運動聯(lián)合膳食控制對降低T2DM大鼠FPG水平無明顯交互作用，但對降低心肌細胞凋亡指數(shù)有顯著交互作用。這表明在糖尿病治療中，有氧運動顯著降低糖尿病大鼠FPG水平，而單純依靠膳食控制并未有效降低糖尿病大鼠FPG水平，在膳食控制基礎(chǔ)上進行有氧運動對降低糖尿病大鼠血糖水平有效。同時，長期有氧運動或膳食控制可有效減少糖尿病心肌細胞凋亡，而有氧運動聯(lián)合膳食控制減少糖尿病心肌細胞凋亡的效果好于單純運動或膳食控制干預(yù)。

3.2 有氧運動和膳食控制干預(yù)糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的機制

生理、生化以及基因的變化等均引起心肌細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2和Fas含量變化對細胞凋亡有重要調(diào)節(jié)作用。Bcl-2通過與Bax結(jié)合成異源二聚體，抑制Bax與線粒體外膜上位點結(jié)合，從而下調(diào)線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)換孔 （mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放，使線粒體外膜免受進一步破壞，減少線粒體雙層膜間的促凋亡物質(zhì)釋放入胞質(zhì)，阻止細胞核內(nèi)DNA鏈被剪切而發(fā)生染色質(zhì)濃縮和胞核皺縮［13］。Fas是胞膜上的一類跨膜受體，F(xiàn)as表達陽性的細胞與配體FasL結(jié)合，通過Fas受體死亡結(jié)合域（Fas associated death domain，F(xiàn)ADD）募集胞內(nèi)caspase-8前體，使其發(fā)生自身水解，進而激活凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3；被Fas/FasL激活的caspase-8將Bcl-2家族中的Bid剪切為更易與線粒體外膜結(jié)合的短鏈，促進線粒體與Bax結(jié)合，破壞線粒體外膜完整性，導(dǎo)致線粒體雙層膜間隙的促凋亡物質(zhì)釋放增加，從而剪切細胞核內(nèi)的DNA鏈，發(fā)生細胞凋亡［14］。因此，多種因素組成的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生。Bojunga等［15］通過注射STZ建立糖尿病大鼠模型，觀察到心肌Bax和Bcl-2表達影響心肌細胞凋亡的發(fā)生，當(dāng)Bax上升Bcl-2下降時，心肌細胞凋亡增加，Bax下降Bcl-2上升時，心肌細胞凋亡減少。凋亡細胞增加時，心肌Fas受體和caspase-8表達增加。張玲等［16］發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠模型建立后8周，心肌細胞凋亡指數(shù)顯著增加，心肌組織Bcl-2蛋白含量顯著降低，Caspase 3含量顯著升高。姜德友等［17］研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠心肌細胞凋亡發(fā)生時，心肌組織Fas免疫組化染色陽性率升高，Bcl-2免疫組化染色陽性率降低。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌組織Bcl-2含量顯著低于正常對照組，而Fas含量顯著高于正常對照組，表明糖尿病機體心肌組織Bcl-2含量減少和Fas含量升高與心肌細胞凋亡有關(guān)。

有關(guān)有氧運動、膳食控制改善糖尿病心肌細胞凋亡的機制目前尚不完全清楚。招少楓等［18］研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病對照組大鼠相比，糖尿病運動大鼠心肌內(nèi)Bcl-2 mRNA表達增加，Bax mRNA表達減少。章潔等［19］研究認(rèn)為，運動可明顯提高心肌細胞膜上PLB磷酸化水平，調(diào)節(jié)心肌肌漿網(wǎng)膜Ca2+-ATP酶（SERCA）對Ca2+的敏感性，SERCA活性升高對減少心肌細胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加有積極意義。心肌細胞內(nèi)Ca2+減少，可阻斷心肌細胞內(nèi)Ca2+激活的凋亡通路，從而減少Ca2+調(diào)節(jié)的Fas陽性表達。本研究通過雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，有氧運動鍛煉或膳食控制對心肌組織Bcl-2含量無明顯影響，而可顯著降低心肌組織Fas含量；而有氧運動聯(lián)合膳食控制對2型糖尿病大鼠心肌組織Bcl-2和Fas含量具有顯著交互作用，使心肌組織Bcl-2含量顯著升高、Fas含量顯著降低。雖然有氧運動或膳食控制引起糖尿病大鼠心肌Bcl-2含量升高不顯著，但升幅達24.3%，其原因可能是樣本數(shù)量較少。因此，升高心肌組織Bcl-2含量和降低Fas含量可能是長期有氧運動聯(lián)合膳食控制減少糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的機制之一。

4 總結(jié)

4.1 糖尿病機體心肌細胞凋亡增多，而心肌組織Bcl-2含量降低和Fas含量升高是引起心肌細胞凋亡增加的重要機制。

4.2 長期有氧運動或膳食控制顯著降低糖尿病大鼠心肌細胞凋亡，且有氧運動聯(lián)合膳食控制對減少糖尿病大鼠心肌細胞凋亡具有顯著的交互作用，升高心肌組織Bcl-2含量、降低心肌組織Fas含量可能是長期有氧運動聯(lián)合膳食控制減少糖尿病大鼠心肌細胞凋亡發(fā)生的機制之一。

［1］West NE，Ruygrok PN，Disco CM，et al.Clinical and angiographic ptedictors of restenosis after stent deployment in diabetes patients.Circulation，2004，109（7）：867-873.

［2］林樂迎，李鴻瑋，王慶志，等.糖尿病心肌病心室重塑及心肌細胞凋亡的研究進展.四川解剖學(xué)雜志，2010，18（1）：20-21.

［3］Sheu JJ，Chang LT，Chiang CH，et al.Impact of diabetes on cardiocyte apoptosis and connexin43 gap junction integrity：Role of pharmacological modulation.Int Heart J，2007，48（2）：233-245.

［4］符麗娟，龐東渤，王洪新.糖尿病大鼠心力衰竭時心肌細胞凋亡的研究.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2005，3（3）：236-237.

［5］Okoshi K，Guimaraes JF，Di Muzio BP，et al.Diabetic cardiomyopathy.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007，51 （2）：160-167.

［6］Fiordaliso F，Li B，Latini R，et al.Myocyte death in streptozotocin induced diabetes rats in angiotens in II dependent.Lab Invest，2000，80（4）：513-527.

［7］符麗娟，楊育紅.槲皮素對糖尿病大鼠心肌非酶糖基化及細胞凋亡的影響.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21 （5）：552-555.

［9］王綿，蘇勝偶，張力輝，等.羅格列酮對2型糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及其基因表達的影響.中國醫(yī)師雜志，2005，7（2）：181-183.

［10］劉欣，趙秀蘭，康毅.糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達研究.中國心血管雜志，2005，10（1）：4-7.

［11］金怡，江鐘立，招少楓，等.低強度運動對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的保護作用.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（1）：15-19.

［12］王寧，阿布力克木·吐爾地，盧雪玲.不同飲食條件糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及誘生型一氧化氮合酶的表達.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（43）：8687-8690.

［13］Uchida T，Minei S，Gao JP.Clinical significance of P53，MDM2 and bcl-2 expression in transitional cell carcinoma of the bladder.Oncol Rep，2002，9（2）：253-259.

［14］Vempati UD，Diaz F，Barrientos A，et al.Role of cytochrome C in apopotsis：increased sensitivity to tumor necrosis factor aplha is associated with respiratory defects but not with lack of cyotchrome C release.Mol Cell Biol，2007，27（5）：1771-1783.

［15］Bojunga J，Nowak D，Mitrou PS，et al.Antioxidative treatment prevents activation of death-receptor and mitochondrion-dependent apoptosis in the hearts of diabetic rats.Diabetologia，2004，47（12）：2072-2080.

［16］張玲，龐莉，高俊虹，等.葛根素對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，17（3）：323-325.

［17］姜德友，柳成剛，樸永植，等.糖心康對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡促進與抑制因子基因表達的調(diào)控作用.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（9）：2114-2115.

［18］招少楓，江鐘立，王磊.飲食和運動干預(yù)對2型糖尿病大鼠心肌Bcl-2和Bax表達的影響.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（5）：393-397.

［19］章潔，江衛(wèi)華，羅達亞，等.運動對1型糖尿病大鼠心肌細胞中磷酸受納蛋白表達的影響.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，49（1）：36-39.