趙平鴿，宋俊英，余陳歡，戴曉燕，嚴云良

(1.浙江義烏市中心醫(yī)院，浙江 義烏 322000;2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053)

草烏為毛茛科植物北烏頭(Aconitum kusnezoffii Reichb)的干燥塊根，具有祛風除濕、溫經(jīng)止痛的功能，用于風寒濕痹、心腹冷痛、麻醉止痛等［1］。主要含有烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿等二萜類生物堿。此類生物堿屬于雙酯型生物堿，毒性極大，它們既是草烏的有效成分，也是其毒性成分［2-3］。酯類生物堿分子中的酯鍵是產(chǎn)生毒性的關(guān)鍵部位，在水中加熱易水解，首先生成苯甲酰烏頭原堿，進一步反應產(chǎn)生烏頭原堿，兩類水解產(chǎn)物毒性極小，但仍有藥理活性［4］。因此，提取過程對草烏的臨床療效具有重要的影響。

近年來，對草烏化學成分的分析及烏頭堿類成分的提取分離已有研究［5-7］，但有關(guān)草烏中酯型生物堿提取的動力學研究未見報道。本研究通過測定不同時間和不同溫度條件下，草烏中酯型生物堿提取過程的動力學參數(shù)，建立了草烏中酯型生物堿提取的動力學模型，以期為草烏的臨床應用以及活性成分的提取提供理論依據(jù)。

1 材料

烏頭堿對照品(批號:110720-200410)，購于中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;生草烏(產(chǎn)地為四川，批號090319)，購于浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠，經(jīng)本校資源鑒定教研室俞冰副教授鑒定為北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb的干燥塊根;其他試劑均為分析純。

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;KQ-5200型超聲波清洗器(40 kHz，200 W)，昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 酯型生物堿含量測定方法的建立

精密稱取烏頭堿對照品22.4mg，置20mL量瓶中，滴入微量甲醇并超聲使其溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.12mg/mL的烏頭堿對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，5.0mL，分別置于25mL 量瓶中，加無水乙醇2.5mL，加堿性鹽酸羥胺試液1.5mL，搖勻，于60～65℃水浴中保溫10 min，放冷，加高氯酸鐵試液稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，于520 nm波長處測定吸光度(A)值，對濃度(C，μg/mL)進行線性回歸［8-10］，得回歸方程:C=668.51 A － 20.02，r=0.999 8。結(jié)果表明，烏頭堿在4.48～224 μg/mL 范圍內(nèi)與A呈良好的線性關(guān)系。

2.2 加樣回收率試驗

取已知酯型生物堿含量的草烏5份，每份分別加入烏頭堿對照品溶液適量，按2.3項下方法回流提取，提取液按2.1項下方法測定含量，結(jié)果烏頭堿的平均回收率為98.86%，RSD(n=5)為2.21%。

2.3 草烏提取液中酯型生物堿的提取及含量測定

將草烏置于圓底燒瓶中，在常壓下回流提取。條件為:以水為提取溶劑，液料比20∶1，草烏顆粒粒度約為0.10 cm，提取溫度分別為60，80和100℃，提取時間為120 min，每間隔10 min取提取液1mL，按2.1項下方法測定提取液中酯型生物堿的含量，并作酯型生物堿的含量與提取時間圖。

2.4 提取溫度與時間對草烏中酯型生物堿提取率的影響

結(jié)果見圖1。提取時間相同時，提取溫度越高，草烏酯型生物堿提取得率越高，說明提取液中溫度對草烏酯型生物堿的提取效果有較大影響。溫度的升高，加快了分子運動速度，有利于擴散傳質(zhì)。在提取前60 min，草烏酯型生物堿的提取率隨溫度的升高和提取時間的延長而迅速提高。在60 min后，80和100℃下，提取液中草烏酯型生物堿的提取率隨提取時間延長變化緩慢，且烏頭堿受熱易發(fā)生水解，生成焦烏頭堿或苯甲酰烏頭堿，致使以烏頭堿為對照品的酯型生物堿含量測定結(jié)果略有變化，100℃時草烏酯型生物堿的提取率略小于60℃時的提取率。

圖1 不同溫度下草烏中酯型生物堿的提取率與時間的關(guān)系Fig.1 The relation between the yield of ester-series alkaloids from Radix Aconiti Kusnezoffii and extraction time at different temperatures

2.5 速率常數(shù)的求解

由圖2可見，不同溫度下的酯型生物堿濃度與提取時間均具有較好的線性關(guān)系(均R2＞0.95)，即符合一級動力學模型(C為提取平衡時固相外溶質(zhì)質(zhì)量濃度)。在同一個反應溫下，酯型生物堿提取的速率是一個常數(shù)K;隨著提取溫度升高，直線斜率相應增大，提取的速率常數(shù)也變大，表明提取溫度越高，溶劑滲透能力越強，溶劑化酯型生物堿的擴散能力也越強。

圖2 不同溫度條件下動力學方程的擬合曲線Fig.2 The fitted curve of kinetic equation at different temperatures

2.6 表觀活化能Ea的求解

在一般情況下，速率常數(shù)與溫度的關(guān)系服從Arrhenius公式。

用不同溫度條件下提取速率常數(shù)K作Arrhenius圖(見圖3)，計算得草烏酯型生物堿提取過程中的活化能為22.33 kJ/mol，證實為內(nèi)擴散控制動力學模型?；罨芊磻怂俾氏禂?shù)對溫度的敏感程度，活化能較大時，速率系數(shù)隨溫度的變化劇烈，因此可以作為提取工藝比較的輔助手段。

圖3 Arrhenius圖Fig.3 The Arrhenius drawing

2.7 半衰期(t1/2)的求解

對圖1的線性模型分別求出60，80和100℃下的t1/2分別為27.84，19.98，32.09 min。t1/2反映了提取效率，且與之成反比例變化，故t1/2越小則對提取越有利。鑒于烏頭堿受熱易發(fā)生水解的特點，因此在本實驗條件下以80℃提取為佳。

3 討論

草烏中酯型生物堿的提取過程是酯型生物堿(溶質(zhì))從草烏藥材粉末內(nèi)部(固相)向溶液(液相)進行擴散的兩相間傳質(zhì)過程［11］，由溶劑向藥材粉末內(nèi)部滲透和擴散、酯型生物堿在滲入藥材粉末內(nèi)部的溶劑中溶解、溶解的酯型生物堿向藥材粉末表面及主體溶液擴散等4個同時發(fā)生的過程組成。溶劑滲透及酯型生物堿的擴散為擴散過程，酯型生物堿的溶解是溶質(zhì)的溶劑化過程。根據(jù)質(zhì)量守恒原理，從藥材粉末中溶出的酯型生物堿等于主體溶液中增加的部分，溶液中酯型生物堿濃度的變化可看作是各微觀變化的綜合反映。故可通過溶液中酯型生物堿濃度的變化來描述復雜的提取過程。

本實驗以Fick定律為基礎，通過假定和簡化，考察了草烏中酯型生物堿提取的動力學，并依此推算出K、Ea、t1/2等動力學參數(shù)。動力學方程表明，提取時間越長，提取率越高，但增高的幅度在下降，因此實際提取過程中并非時間越長越好;提取溫度以80℃為佳;提取溶劑與提取產(chǎn)物通過草烏粉末顆粒多孔介質(zhì)是動力學控制步驟，其提取過程符合一級動力學模型，為內(nèi)擴散控制動力學。本研究結(jié)果可為草烏中酯型生物堿的提取工藝設計與優(yōu)化，以及草烏臨床用藥的療效及毒理研究等提供相應的理論依據(jù)。

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