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        水蛭提取方法及生理活性的研究

        2012-11-17 08:31:28楊培民劉國(guó)飛
        中國(guó)生化藥物雜志 2012年1期

        王 艷,楊培民,代 龍,劉國(guó)飛

        (1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355;2.北京和潤(rùn)創(chuàng)新醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,北京 100021)

        水蛭為臨床常用中藥,廣泛應(yīng)用于各種血瘀癥,《中國(guó)藥典》記載水蛭具有破血通經(jīng),逐瘀消癓等功效[1]。目前水蛭臨床一般以原粉、水煎煮、水煎醇沉等方法應(yīng)用,存在服用量大、易被微生物污染等缺點(diǎn)?,F(xiàn)代藥理研究表明,動(dòng)物類藥材發(fā)揮作用的主要為其小肽類成分[2],因此,筆者擬采用酶解方法得到其小肽類成分,然后與上述幾種常規(guī)方法所得提取液比較生理活性。

        1 材料

        1.1 動(dòng)物

        Wistar大鼠70只,雌雄各半,體重(200±20)g,購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)為:SCXK(魯)20090056。

        1.2 儀器

        高速萬能粉粹機(jī),北京市永光明醫(yī)療儀器廠;W-O型恒溫水浴鍋,上海申順生物科技有限公司;DZF-605型真空干燥箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TDL-5-A離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

        1.3 試劑及藥品

        胃蛋白酶(酶活力1∶3 000,批號(hào):091015)、胰蛋白酶(酶活力1 000~1 500 u/mg,批號(hào):091105),均購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;牛纖維蛋白原(供凝血酶效價(jià)測(cè)定用,批號(hào):140626-2001009),購(gòu)自中國(guó)藥品生物檢定所,臨用前配制為7mg/mL溶液;凝血酶(500 U),購(gòu)自浙江杭康藥業(yè)有限公司,臨用前配制為10 U/mL溶液;瓊脂糖,購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;考馬斯亮藍(lán)R-250,購(gòu)自上海展云化工有限公司,臨用前配制為0.05%溶液;其余試劑均為分析純;

        水蛭購(gòu)自濟(jì)南建聯(lián)中藥店,經(jīng)本校周鳳琴教授鑒定系水蛭科動(dòng)物螞蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全體,60℃真空干燥,粉碎成80目細(xì)粉,備用。

        2 方法

        2.1 樣品的制備

        2.1.1 勻漿提取 取水蛭細(xì)粉100 g,加10倍水勻漿,持續(xù)10 min,取出,離心,上清液濃縮至含生藥量0.2 g/mL,濾過,即為勻漿液。

        2.1.2 水煎煮提取 取水蛭細(xì)粉100 g,加10倍水勻漿,持續(xù)10 min,取出,煮沸30 min,離心,殘?jiān)偌?0倍水煮沸30 min,離心,合并上清液,濃縮至含生藥量0.2 g/mL,濾過,即為水煎煮液。

        2.1.3 水煎醇沉提取 取水蛭細(xì)粉100 g,加10倍水勻漿,持續(xù)10 min,取出,煮沸30 min,離心,殘?jiān)偌?0倍水煮沸30 min,離心,合并上清液,加入乙醇使含醇量達(dá)70%,靜置12 h,濾過,濾液減壓回收乙醇,濃縮至含生藥量0.2 g/mL,濾過,即為水提醇沉液。

        2.1.4 胃蛋白酶酶解提取 取水蛭細(xì)粉100 g,加10倍水勻漿,持續(xù)10 min,取出,煮沸15 min,冷至40℃,調(diào)pH至2.0,加入藥材量1%的胃蛋白酶,40℃保溫酶解4 h,取出,煮沸30 min,離心,取上清液,濃縮至含生藥量0.2 g/mL,微孔濾膜濾過,即為胃蛋白酶酶解液。

        2.1.5 胰蛋白酶酶解提取 取水蛭細(xì)粉100 g,加10倍水勻漿,持續(xù)10 min,取出,煮沸15 min,冷至40℃,調(diào)pH至8.0,加入藥材量1%的胰蛋白酶,40℃保溫酶解4 h,取出,煮沸30 min,離心,取上清液,濃縮至含生藥量0.2 g/mL,濾過,即為胰蛋白酶酶解液。

        2.1.6 仿生酶解提取 取水蛭細(xì)粉100 g,加10倍水勻漿,持續(xù) 10 min,取出,煮沸 15 min,放冷至40℃,調(diào)pH至2.0,加入藥材量1%的胃蛋白酶,40℃保溫酶解1 h,調(diào)pH至8.0,加入藥材量1%的胰蛋白酶,40℃保溫酶解3 h,取出,煮沸30 min,離心,取上清液,濃縮至含生藥量0.2 g/mL,濾過,即得仿生酶解液。

        2.2 得膏率的測(cè)定

        取提取液各25mL,濃縮,干燥,計(jì)算得膏率。

        2.3 抗凝活性

        凝血酶原時(shí)間(PT)法[3]:大鼠腹腔靜脈取血,3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝,混合后,以3 000 r/min 離心15 min,取上清液,得到貧血小板血漿,分別取血漿0.1mL,加入樣品液0.1mL,混勻,37 ℃保溫30 min,再加入已預(yù)熱至37℃的凝血酶溶液(10 U/mL)0.2mL,混勻,記錄出現(xiàn)絮狀沉淀所需時(shí)間。

        2.4 溶纖活性

        取瓊脂糖0.8 g,加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)100mL,加熱使溶解,冷卻至55℃,加入纖維蛋白原溶液(7 g/mL)8mL及凝血酶溶液(10 U/mL)5mL,混勻,立即倒入已預(yù)熱的培養(yǎng)皿中,待冷卻后轉(zhuǎn)移至7℃冰箱中放置20 min,用直徑0.5 cm打孔器打孔。每個(gè)孔中均加入不同上述樣品液20μL,以生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)做空白對(duì)照,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h。取出,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色20 min,脫色液脫色,觀察纖維蛋白溶圈,記錄溶圈垂直直徑[4]。

        2.5 大鼠凝血時(shí)間(CT)及靜脈血栓重量(TW)

        取Wistar大鼠70只,雌雄各半,體重(200±20)g,隨機(jī)分為7組,每組10只,按表3分組。樣品液組灌胃給藥,1次/d,給藥劑量均為相當(dāng)于生藥量 0.4 g/kg。

        空白對(duì)照組灌胃給予同體積生理鹽水,連續(xù)7d。末次給藥后1 h,各組動(dòng)物腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉麻醉,剖腹分離下腔靜脈,于左腎靜脈下穿一絲線結(jié)扎下腔靜脈管,造成瘀血,關(guān)閉腹腔。6 h后,用內(nèi)徑為1 mm的玻璃毛細(xì)管插入鼠內(nèi)眥靜脈叢取血,至毛細(xì)管血柱達(dá)5 mm,每隔30 s折斷毛細(xì)管一段,檢查有無出現(xiàn)凝血絲,計(jì)算毛細(xì)管采血到出現(xiàn)血凝絲時(shí)間,即為凝血時(shí)間。再次打開腹腔,于結(jié)扎下方2 cm處夾閉血管,縱行剖開,取出血栓,記錄血栓重量[5-6]。

        3 結(jié)果

        3.1 各種提取方法對(duì)得膏率的影響

        結(jié)果見表1。

        3.2 各種提取方法對(duì)抗凝活性、溶纖活性的影響

        結(jié)果見表2。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組抗凝活性與空白對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05);各酶解組PT較勻漿液組有較大延長(zhǎng),與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01),其中胃蛋白酶酶解液組與勻漿液組相比有顯著性差異(P<0.05),仿生酶解液組與勻漿液組相比有極顯著性差異(P<0.01)。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組纖溶活性與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05);各酶解液組纖溶活性與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01),其中仿生酶解液組與勻漿液組相比有極顯著性差異(P<0.01)。

        表2 抗凝活性、溶纖活性的測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)Tab.2 Result of anticoagulant and thrombolysis(±s,n=10)

        與空白對(duì)照組比較:1P<0.05,2 P<0.01;與勻漿組比較:3P<0.05,4 P<0.011P<0.05,2 P< 0.01 vs control group;3P< 0.05,4P< 0.01 vs homogenate group

        組 別 PT/s 溶纖活性/mm勻漿液 23.15±2.451 8.7±2.11水煎煮液 24.67±2.271 10.6±1.61水煎醇沉液 22.35±3.161 10.9±1.61胃蛋白酶酶解液 31.47±2.532,3 14.9±1.82,3胰蛋白酶酶解液 29.65±1.952 14.5±2.12仿生酶解液 45.12±2.562,4 20.9±2.12,4空白對(duì)照液15.49±1.85 5.1±0.2

        3.3 提取方法對(duì)大鼠CT及TW的影響

        結(jié)果見表3。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組CT、TW與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05);各酶解液組CT、TW與空白對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01),其中胰蛋白酶酶解液組CT、TW與勻漿液組相比均有顯著性差異(P<0.05),仿生酶解液組CT、TW與勻漿液組相比有極顯著性差異(P<0.01)。

        表3 大鼠CT及TW測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)Tab.3 Result of clotting time and venous thrombosis(±s,n=10)

        表3 大鼠CT及TW測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)Tab.3 Result of clotting time and venous thrombosis(±s,n=10)

        與空白對(duì)照組比較:1 P<0.05,2 P<0.01;與勻漿液組比較:3 P<0.05,4 P<0.011P<0.05,2P< 0.01 vs control group;3P< 0.05,4P< 0.01 vs homogenate group

        煎醇沉液組蛋白酶酶解液組 105.30±13.272 18.73±3.062,3胰蛋白酶酶解液組 111.81±21.562,3 17.47±2.142,3仿生酶解液組 160.57±21.262,4 14.35±2.682,4空白對(duì)照組61.85±11.24 21.34±2.96

        4 討論

        水蛭為貴重藥材,一般的勻漿法、水煎煮、水煎醇沉等工藝的得膏率較低,其藥材利用率低,提取后的藥渣仍有較大活性;胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解得膏率稍有增加,但仍不能使藥材得到較好的利用;仿生酶解法的得膏率高,酶解后的藥渣基本沒有活性,能夠較好的利用藥材,是理想的水蛭提取方法。

        水蛭藥材細(xì)粉經(jīng)勻漿后,為使大分子蛋白受熱變性,破壞其空間結(jié)構(gòu),從而易于蛋白質(zhì)的水解,故先煮沸15 min。

        本研究創(chuàng)新性提出,模擬人體消化過程,對(duì)動(dòng)物類藥材采用先以胃蛋白酶酶解、再以胰蛋白酶酶解的仿生酶解方法。參考文獻(xiàn)[7-8],確定本實(shí)驗(yàn)中胃蛋白酶的反應(yīng)條件為40℃,pH 2.0,時(shí)間1 h;胰蛋白酶反應(yīng)條件為40℃,pH 8.0,時(shí)間3 h。

        朱正光等[9]研究發(fā)現(xiàn),水蛭水煎液及其醇溶部分含抗凝活性物質(zhì),水煎液及其非醇溶部分含纖溶活性物質(zhì)。本文采用仿生酶解的方法,將水蛭中的大分子蛋白酶解成水溶性的小分子肽,所得的酶解液同時(shí)具有抗凝及纖溶活性,而且較水煎液的活力更強(qiáng),可更大程度提高生物利用度,降低毒副反應(yīng)發(fā)生率。

        水蛭細(xì)粉直接口服,只有少部分經(jīng)胃腸道消化吸收,大部分以原型排出體外,大大浪費(fèi)藥材。而經(jīng)體外仿生酶解后,將大分子的蛋白直接降解為小分子的肽,與人體經(jīng)自身胃腸道消化吸收的物質(zhì)相同,能直接吸收入血,生物利用度高,抗凝血、溶栓作用等生理活性更強(qiáng),而且比一般的酶解方法更優(yōu),說明對(duì)水蛭進(jìn)行體外仿生酶解得到小肽是一種極好的提高藥物療效的方法。

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