王 艷，楊培民，代 龍，劉國飛

(1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355;2.北京和潤創(chuàng)新醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，北京 100021)

水蛭為臨床常用中藥，廣泛應用于各種血瘀癥，《中國藥典》記載水蛭具有破血通經(jīng)，逐瘀消癓等功效［1］。目前水蛭臨床一般以原粉、水煎煮、水煎醇沉等方法應用，存在服用量大、易被微生物污染等缺點。現(xiàn)代藥理研究表明，動物類藥材發(fā)揮作用的主要為其小肽類成分［2］，因此，筆者擬采用酶解方法得到其小肽類成分，然后與上述幾種常規(guī)方法所得提取液比較生理活性。

1 材料

1.1 動物

Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重(200±20)g，購自山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號為:SCXK(魯)20090056。

1.2 儀器

高速萬能粉粹機，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;W-O型恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司;DZF-605型真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 試劑及藥品

胃蛋白酶(酶活力1∶3 000，批號:091015)、胰蛋白酶(酶活力1 000～1 500 u/mg，批號:091105)，均購自上海藍季科技發(fā)展有限公司;牛纖維蛋白原(供凝血酶效價測定用，批號:140626-2001009)，購自中國藥品生物檢定所，臨用前配制為7mg/mL溶液;凝血酶(500 U)，購自浙江杭康藥業(yè)有限公司，臨用前配制為10 U/mL溶液;瓊脂糖，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;考馬斯亮藍R-250，購自上海展云化工有限公司，臨用前配制為0.05%溶液;其余試劑均為分析純;

水蛭購自濟南建聯(lián)中藥店，經(jīng)本校周鳳琴教授鑒定系水蛭科動物螞蝗Whitmania pigra Whitman的干燥全體，60℃真空干燥，粉碎成80目細粉，備用。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 勻漿提取 取水蛭細粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，離心，上清液濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即為勻漿液。

2.1.2 水煎煮提取 取水蛭細粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，煮沸30 min，離心，殘渣再加10倍水煮沸30 min，離心，合并上清液，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即為水煎煮液。

2.1.3 水煎醇沉提取 取水蛭細粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，煮沸30 min，離心，殘渣再加10倍水煮沸30 min，離心，合并上清液，加入乙醇使含醇量達70%，靜置12 h，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即為水提醇沉液。

2.1.4 胃蛋白酶酶解提取 取水蛭細粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，煮沸15 min，冷至40℃，調(diào)pH至2.0，加入藥材量1%的胃蛋白酶，40℃保溫酶解4 h，取出，煮沸30 min，離心，取上清液，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，微孔濾膜濾過，即為胃蛋白酶酶解液。

2.1.5 胰蛋白酶酶解提取 取水蛭細粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù)10 min，取出，煮沸15 min，冷至40℃，調(diào)pH至8.0，加入藥材量1%的胰蛋白酶，40℃保溫酶解4 h，取出，煮沸30 min，離心，取上清液，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即為胰蛋白酶酶解液。

2.1.6 仿生酶解提取 取水蛭細粉100 g，加10倍水勻漿，持續(xù) 10 min，取出，煮沸 15 min，放冷至40℃，調(diào)pH至2.0，加入藥材量1%的胃蛋白酶，40℃保溫酶解1 h，調(diào)pH至8.0，加入藥材量1%的胰蛋白酶，40℃保溫酶解3 h，取出，煮沸30 min，離心，取上清液，濃縮至含生藥量0.2 g/mL，濾過，即得仿生酶解液。

2.2 得膏率的測定

取提取液各25mL，濃縮，干燥，計算得膏率。

2.3 抗凝活性

凝血酶原時間(PT)法［3］:大鼠腹腔靜脈取血，3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，混合后，以3 000 r/min 離心15 min，取上清液，得到貧血小板血漿，分別取血漿0.1mL，加入樣品液0.1mL，混勻，37 ℃保溫30 min，再加入已預熱至37℃的凝血酶溶液(10 U/mL)0.2mL，混勻，記錄出現(xiàn)絮狀沉淀所需時間。

2.4 溶纖活性

取瓊脂糖0.8 g，加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)100mL，加熱使溶解，冷卻至55℃，加入纖維蛋白原溶液(7 g/mL)8mL及凝血酶溶液(10 U/mL)5mL，混勻，立即倒入已預熱的培養(yǎng)皿中，待冷卻后轉(zhuǎn)移至7℃冰箱中放置20 min，用直徑0.5 cm打孔器打孔。每個孔中均加入不同上述樣品液20μL，以生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)做空白對照，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h。取出，用考馬斯亮藍R-250染色20 min，脫色液脫色，觀察纖維蛋白溶圈，記錄溶圈垂直直徑［4］。

2.5 大鼠凝血時間(CT)及靜脈血栓重量(TW)

取Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重(200±20)g，隨機分為7組，每組10只，按表3分組。樣品液組灌胃給藥，1次/d，給藥劑量均為相當于生藥量 0.4 g/kg。

空白對照組灌胃給予同體積生理鹽水，連續(xù)7d。末次給藥后1 h，各組動物腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉麻醉，剖腹分離下腔靜脈，于左腎靜脈下穿一絲線結(jié)扎下腔靜脈管，造成瘀血，關(guān)閉腹腔。6 h后，用內(nèi)徑為1 mm的玻璃毛細管插入鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，至毛細管血柱達5 mm，每隔30 s折斷毛細管一段，檢查有無出現(xiàn)凝血絲，計算毛細管采血到出現(xiàn)血凝絲時間，即為凝血時間。再次打開腹腔，于結(jié)扎下方2 cm處夾閉血管，縱行剖開，取出血栓，記錄血栓重量［5-6］。

3 結(jié)果

3.1 各種提取方法對得膏率的影響

結(jié)果見表1。

3.2 各種提取方法對抗凝活性、溶纖活性的影響

結(jié)果見表2。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組抗凝活性與空白對照組有顯著性差異(P＜0.05);各酶解組PT較勻漿液組有較大延長，與空白對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，其中胃蛋白酶酶解液組與勻漿液組相比有顯著性差異(P＜0.05)，仿生酶解液組與勻漿液組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組纖溶活性與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05);各酶解液組纖溶活性與空白對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，其中仿生酶解液組與勻漿液組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。

表2 抗凝活性、溶纖活性的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab.2 Result of anticoagulant and thrombolysis(±s，n=10)

與空白對照組比較:1P＜0.05，2 P＜0.01;與勻漿組比較:3P＜0.05，4 P＜0.011P＜0.05，2 P＜ 0.01 vs control group;3P＜ 0.05，4P＜ 0.01 vs homogenate group

組 別 PT/s 溶纖活性/mm勻漿液 23.15±2.451 8.7±2.11水煎煮液 24.67±2.271 10.6±1.61水煎醇沉液 22.35±3.161 10.9±1.61胃蛋白酶酶解液 31.47±2.532，3 14.9±1.82，3胰蛋白酶酶解液 29.65±1.952 14.5±2.12仿生酶解液 45.12±2.562，4 20.9±2.12，4空白對照液15.49±1.85 5.1±0.2

3.3 提取方法對大鼠CT及TW的影響

結(jié)果見表3。勻漿液、水煎煮液、水煎醇沉液組CT、TW與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05);各酶解液組CT、TW與空白對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，其中胰蛋白酶酶解液組CT、TW與勻漿液組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，仿生酶解液組CT、TW與勻漿液組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。

表3 大鼠CT及TW測定結(jié)果(±s，n=10)Tab.3 Result of clotting time and venous thrombosis(±s，n=10)

表3 大鼠CT及TW測定結(jié)果(±s，n=10)Tab.3 Result of clotting time and venous thrombosis(±s，n=10)

與空白對照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01;與勻漿液組比較:3 P＜0.05，4 P＜0.011P＜0.05，2P＜ 0.01 vs control group;3P＜ 0.05，4P＜ 0.01 vs homogenate group

煎醇沉液組蛋白酶酶解液組 105.30±13.272 18.73±3.062，3胰蛋白酶酶解液組 111.81±21.562，3 17.47±2.142，3仿生酶解液組 160.57±21.262，4 14.35±2.682，4空白對照組61.85±11.24 21.34±2.96

4 討論

水蛭為貴重藥材，一般的勻漿法、水煎煮、水煎醇沉等工藝的得膏率較低，其藥材利用率低，提取后的藥渣仍有較大活性;胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解得膏率稍有增加，但仍不能使藥材得到較好的利用;仿生酶解法的得膏率高，酶解后的藥渣基本沒有活性，能夠較好的利用藥材，是理想的水蛭提取方法。

水蛭藥材細粉經(jīng)勻漿后，為使大分子蛋白受熱變性，破壞其空間結(jié)構(gòu)，從而易于蛋白質(zhì)的水解，故先煮沸15 min。

本研究創(chuàng)新性提出，模擬人體消化過程，對動物類藥材采用先以胃蛋白酶酶解、再以胰蛋白酶酶解的仿生酶解方法。參考文獻［7-8］，確定本實驗中胃蛋白酶的反應條件為40℃，pH 2.0，時間1 h;胰蛋白酶反應條件為40℃，pH 8.0，時間3 h。

朱正光等［9］研究發(fā)現(xiàn)，水蛭水煎液及其醇溶部分含抗凝活性物質(zhì)，水煎液及其非醇溶部分含纖溶活性物質(zhì)。本文采用仿生酶解的方法，將水蛭中的大分子蛋白酶解成水溶性的小分子肽，所得的酶解液同時具有抗凝及纖溶活性，而且較水煎液的活力更強，可更大程度提高生物利用度，降低毒副反應發(fā)生率。

水蛭細粉直接口服，只有少部分經(jīng)胃腸道消化吸收，大部分以原型排出體外，大大浪費藥材。而經(jīng)體外仿生酶解后，將大分子的蛋白直接降解為小分子的肽，與人體經(jīng)自身胃腸道消化吸收的物質(zhì)相同，能直接吸收入血，生物利用度高，抗凝血、溶栓作用等生理活性更強，而且比一般的酶解方法更優(yōu)，說明對水蛭進行體外仿生酶解得到小肽是一種極好的提高藥物療效的方法。

［1］中國藥典［S］.一部.2010:77.

［2］Shimonishi Y.Peptide Science-Present and Future［M］.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers，1999:436-441.

［3］徐淑云.藥理學實驗方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:1270.

［4］Astrup T，Mullertz S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity［J］.Arch Biochem Biophys，1952，40:346-351.

［5］徐 西，盧建秋，王碩仁，等.水蛭不同提取物抗凝作用的實驗研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，1994，17(3):36-38.

［6］王 征，陳曉光，吳 巖.土鱉蟲溶栓酶抗凝血及抗血栓作用的實驗研究［J］.中國實驗診斷學，2007，11(9):1143-1145.

［7］錢 方，鄧 巖，劉 陽，等.胃蛋白酶水解大豆蛋白的研究［J］.中國乳品工業(yè)，2001，29(3):10-13.

［8］黃開華，周艷明，吳 畏，等.胰蛋白酶酶解鹿血條件的優(yōu)化［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2007，46(2):302-305.

［9］朱正光，吳曙光，孫燕榮.水蛭水煎液抗栓作用機制的體外實驗研究［J］.中國生化藥物雜志，2001，22(5):229-231.