蘇 玲，李雨婷，宋 慧，呂金超

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

小刺猴頭菌［H.caput-medusae(Bull.∶Fr.)Pers］與猴 頭 菌 ［Hericium erinaceus(Bull.∶Fr.)Pers］、假猴頭菌［H.laciniatum(Leers)Banker］、珊瑚狀 猴 頭 菌 ［H.coralloides(Scop.∶Fr.)Pers.exGray］同為猴頭菌屬。從猴頭菌屬中提取分離得到多糖、甾醇類、萜類、酚類、脂肪酸等多種成分，可用于治療消化不良、胃潰瘍、食道癌、胃癌、十二指腸癌等消化系統(tǒng)疾?。?-2］。

小刺猴頭菌與猴頭菌外觀相似，已有研究多集中于猴頭菌子實(shí)體或菌絲體化學(xué)成分組成、結(jié)構(gòu)分析及藥理學(xué)活性等方面。對(duì)小刺猴頭菌的研究報(bào)道較少，對(duì)其液體深層發(fā)酵產(chǎn)物的藥理學(xué)活性報(bào)道更是鮮見。因此，本研究以小刺猴頭菌液體深層發(fā)酵浸膏多糖為材料，對(duì)其抗腫瘤活性作了初步研究，以期補(bǔ)充和豐富對(duì)猴頭菌屬的認(rèn)識(shí)，為更全面、深入地開發(fā)小刺猴頭菌提供理論依據(jù)。

1 材料

小刺猴頭菌液體深層發(fā)酵浸膏由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)大制藥廠提供。

S180腹水小鼠購自長春腫瘤研究所;KM小鼠購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號(hào):10-1023);人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1、人胃癌細(xì)胞SGC7901由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物物理實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng);人肝癌細(xì)胞SMMC7721由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

RPMI 1640(Gibco);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶、MTT(Amresco);注射用環(huán)磷酰胺(上海華聯(lián)制藥有限公司);DMSO(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司);鏈霉素、青霉素(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)。

TS100倒置顯微鏡(Nikon);DG5032酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國賀利氏公司)。

2 方法

2.1 小刺猴頭菌發(fā)酵浸膏多糖HFP和HFA的提取

小刺猴頭菌發(fā)酵浸膏經(jīng)95%乙醇浸泡過夜脫脂，去除乙醇，加3倍體積水溶解，80℃水浴提取3 h，去除不溶物，冷卻，加入95%乙醇至終濃度75%，4℃過夜，離心分離沉淀及上清液，濃縮干燥即為HFP和HFA。

2.2 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，設(shè)空白對(duì)照孔、正常對(duì)照孔及不同藥物濃度試驗(yàn)孔，同時(shí)設(shè)顏色對(duì)照孔，每組設(shè)6個(gè)平行孔，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，吸棄上清，在藥物試驗(yàn)孔中分別加入藥物濃度為15.625，31.25，62.5，125，250，500，1 000，2 000 μg/mL 的培養(yǎng)液200 μL，正常對(duì)照孔只加細(xì)胞和培養(yǎng)液，顏色對(duì)照孔不加細(xì)胞只加含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44或68 h，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃孵育4 h后棄去孔內(nèi)溶液，每孔加入DMSO 150μL輕度振蕩10 min使沉淀完全溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長測(cè)定吸光度(A)值，并設(shè)630 nm為參考波長。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑制率(IC)。IC=1 － (A藥物－ A顏色對(duì)照)/(A正常對(duì)照－A空白對(duì)照)×100%。

2.3 HFP體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

2.3.1 分組及給藥 KM鼠80只，雌性，隨機(jī)分為8組，每組10只，即模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組、低劑量預(yù)防組、中劑量預(yù)防組和高劑量預(yù)防組。接種S180肉瘤細(xì)胞前5 d，低、中、高預(yù)防組分別按小鼠每千克體重灌服50，100 和200mg HFP，0.4mL/只，連續(xù)5 d，1次/d;其余5組灌服生理鹽水0.4mL/只，連續(xù)5 d，1次/d。實(shí)驗(yàn)第6天灌胃前，無菌抽取腹腔注射S180肉瘤細(xì)胞7d的小鼠腹水，經(jīng)無菌生理鹽水洗滌，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次。生理鹽水重懸，臺(tái)盼蘭染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，混勻，每只小鼠右前肢腋下皮下注射0.2mL。接瘤后，低、中、高預(yù)防組分別按前述給藥方式、劑量繼續(xù)灌服HFP 10 d;低、中、高治療組分別灌服HFP 50，100和200mg/kg;陽性對(duì)照組灌服CTX 100mg/kg;模型對(duì)照組灌服生理鹽水;灌胃體檢均為0.4mL/只，均連續(xù)給藥15 d，1次/d。

2.3.2 S180肉瘤荷瘤小鼠體重、瘤重、抑瘤率及脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食飲水，于給藥第1，5，10，15 天，稱量并記錄體重。末次給藥24 h后，斷頸處死小鼠。處死前稱量各組小鼠體重并記錄，完整剝?nèi)∮疑现鲶w，稱重并記錄，并按下列公式計(jì)算抑瘤率。同時(shí)摘取小鼠脾臟和胸腺，分別稱重并計(jì)算脾系數(shù)和胸腺系數(shù)。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見圖1。濃度在15.625～2 000μg/mL的HFP和HFA對(duì)SMMC7721、SPC-A-1、SGC7901的作用大體呈劑量依賴關(guān)系，但HFP的作用效果好于HFA。長時(shí)間作用普遍好于短時(shí)間作用效果。其中HFP作用SPC-A-1 72 h時(shí)對(duì)癌細(xì)胞的抑制率達(dá)70.5%。

3.2 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

3.2.1 HFP對(duì)S180荷瘤小鼠體重的影響 結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)第5天CTX組及低、中、高劑量HFP預(yù)防組小鼠體重略有下降，與模型對(duì)照組比較有極顯著差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)第10天，低、中、高劑量HFP預(yù)防組小鼠體重已恢復(fù)至模型對(duì)照組水平，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);CTX組體重略有回升，但與模型對(duì)照組比較差異仍為極顯著(P＜0.01)。至實(shí)驗(yàn)最后1 d處死小鼠前稱重結(jié)果顯示，CTX組體重仍未恢復(fù)至模型對(duì)照組水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P＜0.01)。同時(shí)，低劑量HFP治療組小鼠體重與模型對(duì)照組比較，達(dá)極顯著差異水平(P＜0.01)。

圖1 HFP和HFA對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721(A)、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1(B)、人胃癌細(xì)胞SGC7901(C)的抑制率Fig.1 The inhibition ratio of HFP and HFA to SMMC7721(A)、SPC-A-1(B)、SGC7901(C)

表1 S180荷瘤小鼠體重、瘤重和抑瘤率(n=10，±s)Tab.1 The body weights，tumor weights and inhibition rates of S180 mice(n=10，±s)

表1 S180荷瘤小鼠體重、瘤重和抑瘤率(n=10，±s)Tab.1 The body weights，tumor weights and inhibition rates of S180 mice(n=10，±s)

與模型對(duì)照組比較:1 P＜0.01;與陽性對(duì)照組比較:2 P＜0.01Compared with model control group:1 P＜0.01;Compared with CTX group:2 P＜0.01

?

3.2.2 瘤重及抑瘤率 結(jié)果見表1。所有給藥組小鼠瘤重與模型對(duì)照組比較均達(dá)極顯著差異水平(P＜0.01)。至實(shí)驗(yàn)最后1 d處死小鼠時(shí)，中、高劑量預(yù)防組小鼠腋下無肉瘤生長，即抑制腫瘤發(fā)生率為100%。HFP治療組對(duì)腫瘤的生長抑制作用隨給藥劑量增大而變強(qiáng)，抑瘤率由40%上升至86.6%，但仍顯著低于同等給藥劑量HFP預(yù)防組。此外，高劑量治療組和低劑量預(yù)防組的抑瘤率(86.6%和88.6%)，與CTX 組的88.7%比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

3.2.3 胸腺系數(shù)及脾系數(shù) 各組S180荷瘤小鼠胸腺及脾系數(shù)見表2。CTX組的脾系數(shù)和胸腺系數(shù)與模型對(duì)照組比較均達(dá)極顯著差異水平(P＜0.01)。3個(gè)劑量的HFP預(yù)防組脾系數(shù)與模型對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)，其中低劑量預(yù)防組差異達(dá)極顯著(P＜0.01)。3個(gè)HFP治療組脾系數(shù)的大小與給藥劑量呈正相關(guān)，且均高于HFP預(yù)防組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而胸腺系數(shù)則隨給藥劑量的升高而降低。HFP預(yù)防組的胸腺系數(shù)有隨給藥劑量增大而升高的趨勢(shì)。

4 討論

腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見病和多發(fā)病。一直以來，對(duì)于真菌多糖類物質(zhì)的抗癌機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要集中于增強(qiáng)機(jī)體免疫力，如提高巨噬細(xì)胞吞噬活性、增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷作用、促進(jìn)免疫球蛋白的形成等作用［3-5］，間接地抵制腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、惡化。從本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果可以推測(cè)，HFP和HFA對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的抑制率高低與細(xì)胞種類有關(guān)，其抗瘤活性具有選擇性和特異性，即其可靶向作用于某些腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞正常生長。HFP和HFA表現(xiàn)出的體外抗腫瘤活性，可能是其特定的空間構(gòu)象與細(xì)胞膜表面的特異性受體識(shí)別并結(jié)合(如死亡受體，F(xiàn)as等)，從而誘導(dǎo)凋亡基因表達(dá)、激活凋亡酶，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［6］。

表2 S180荷瘤小鼠胸腺系數(shù)及脾系數(shù)(n=10，±s)Tab.2 The coefficient of thymus and spleen(n=10，±s)

表2 S180荷瘤小鼠胸腺系數(shù)及脾系數(shù)(n=10，±s)Tab.2 The coefficient of thymus and spleen(n=10，±s)

與模型對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with model control group:1 P＜0.05，2 P＜0.01

組 別 劑量/(mg/kg)胸腺系數(shù)/(mg/g)脾系數(shù)/(mg/g)模型對(duì)照組 － 3.386±0.475 11.224±3.239陽性對(duì)照組 100 1.026±0.2722 3.026±1.4502低劑量治療組 50 3.710±0.756 8.410±3.344中劑量治療組 100 3.603±0.648 9.716±2.450高劑量治療組 200 3.190±0.600 11.264±3.278低劑量預(yù)防組 50 3.631±0.587 7.429±2.1091中劑量預(yù)防組 100 3.700±0.693 8.247±1.0701高劑量預(yù)防組 200 3.979±0.876 5.614±0.9682

另外，真菌糖類物質(zhì)多樣的生物學(xué)活性與其空間立體結(jié)構(gòu)密不可分，而其空間構(gòu)型取決于其單糖組成，連鍵方式，分子質(zhì)量大小等一級(jí)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為，具有生物活性的真菌多糖多為β(1→3)連接的主鏈和β(1→6)連接的葡聚糖。丁劍［7］研究報(bào)道:小刺猴頭菌深層發(fā)酵液多糖HMP的結(jié)構(gòu)為{-(1→4)Glu］3-(1→6)Glu}n-，而本實(shí)驗(yàn)所用發(fā)酵浸膏為發(fā)酵液和發(fā)酵菌絲體的混合物，提取所得的兩種多糖的單糖組成及結(jié)構(gòu)等還有待進(jìn)一步研究。

［1］宋 慧.猴頭菌化學(xué)成分研究及菌種篩選［D］.長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

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［3］王月穎，劉正國，李興玉.梁金菇多糖誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的研究［J］.中國中藥雜志，2004，29(12):1170-1173.

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［6］樊黎生.黑木耳多糖AAP-IIa級(jí)分的制備及其生物活性的研究［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［7］丁 劍.猴頭菌屬猴頭菌種不同菌株發(fā)酵液多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)研究［D］.長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.