張 恒，王月英，李德冠，王小春，路 璐，吳紅英，常建輝，翟志斌，孟愛(ài)民

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192)

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是由于生物、化學(xué)、物理等因素導(dǎo)致造血組織功能減退或衰竭而引起全血細(xì)胞減少，臨床表現(xiàn)為貧血、感染、出血等癥狀的一組綜合征，是造血系統(tǒng)比較常見(jiàn)的疾病［1］。目前臨床上廣泛使用的治療方法都存在缺點(diǎn)，如雄激素法對(duì)改善血小板效果不佳且副作用大，骨髓移植法配型困難且遠(yuǎn)期免疫抑制劑使用成本高，免疫抑制劑法成本高且遠(yuǎn)期并發(fā)癥嚴(yán)重;開發(fā)安全、有效、成本低的AA治療方法具有良好的臨床應(yīng)用前景。

E838(17a-D-高炔雌二醇-3-乙酯)是我們對(duì)炔雌醇結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造合成的一種新型雌激素類化合物，分子式為C23H28O3，相對(duì)分子質(zhì)量352。我們研究小組前期研究表明，E838、炔雌醇、尼爾雌醇、雌三醇等雌激素類物質(zhì)對(duì)放療、化療導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷具有一定的防護(hù)作用［2］，其中E838的防護(hù)作用最強(qiáng)、雌激素活性最低［3］，在放化療病人恢復(fù)造血機(jī)能的臨床應(yīng)用上具有良好前景。在本項(xiàng)研究中，我們改進(jìn)了Barnes的經(jīng)典造模方法［4］，采用電離輻射和免疫介導(dǎo)結(jié)合的方法誘導(dǎo)小鼠AA模型并用E838進(jìn)行干預(yù)，考察外周血常規(guī)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(Reticulocyte，Ret)計(jì)數(shù)和骨髓病理等多項(xiàng)指標(biāo)，評(píng)估AA動(dòng)物模型的有效性和E838對(duì)AA的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

近交系BALB/c小鼠30只，體重20～22 g，雄性，由中國(guó)輻射防護(hù)研究院提供，合格證號(hào):SCXK(京)2007-0001;近交系DBA/2小鼠2只，體重22～24 g，雄性，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào):SCXK(京)2005-0013。飼料為清潔級(jí)全價(jià)鼠料，由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供。

1.2 試劑及儀器

E838為我所自行制備;注射用茶油，天津氨基酸公司生產(chǎn)，配制E838使用液，濃度為750μg/mL。

pocH-100i自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，日本希森美康株式會(huì)社;BX51正置顯微鏡，日本奧林巴斯公司;RM2235石蠟切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司。

1.3 照射條件

天津市物理技術(shù)研究所60Co源γ射線，劑量為5.0 Gy，劑量率為1.1 Gy/min。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 取生長(zhǎng)良好的BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，即對(duì)照組、AA模型組(AA組)、E838干預(yù)組(E838組)。

1.4.2 動(dòng)物處理 對(duì)照組進(jìn)行假照射，AA組、E838組進(jìn)行全身照射;AA組、E838組小鼠參考Barnes方法［4］建立AA動(dòng)物模型;E838組小鼠建模后給E838茶油溶液進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 給藥方式 E838組劑量為75μg(0.1mL)/只，制備模型當(dāng)天灌胃給藥，其余各組小鼠給予等體積茶油，1次/d，連續(xù)14 d。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 一般生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 包括一般行為、毛發(fā)、出血點(diǎn)及死亡情況。

1.5.2 外周血常規(guī)參數(shù)測(cè)定模型制備至第15天，小鼠稱重，眼球取血200μL，EDTA-K3抗凝，用自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定外周血白細(xì)胞數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)等指標(biāo)。

1.5.3 Ret計(jì)數(shù) 眼球取血100μL，加入1%煌焦油藍(lán)溶液50μL，混勻放入37℃水浴鍋中染色15 min，取出后推片，再進(jìn)行瑞氏染色，油鏡下計(jì)數(shù)1 000個(gè)紅細(xì)胞中的Ret。

1.5.4 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù) 處死小鼠，取小鼠左側(cè)股骨，用沖洗液2mL沖出骨髓，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上測(cè)定骨髓有核細(xì)胞數(shù)。

1.5.5 病理學(xué)觀察 取小鼠右側(cè)股骨，常規(guī)固定、脫水、脫鈣、石蠟包埋，石蠟塊用石蠟切片機(jī)制作5 μm切片，切片HE染色后用中性樹脂封片，用正置顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料處理用SPSS16.0版軟件包進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果以(±s)表示，經(jīng)Levene檢驗(yàn)后，采用LSD法檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般生長(zhǎng)狀況

從第5天開始，AA組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)活動(dòng)減少、攝食減少，第8天出現(xiàn)腹部凹陷、體重下降等情況;E838組小鼠較AA組狀況好，未出現(xiàn)腹部凹陷的情況，體重降低不明顯;至第15天所有小鼠均未出現(xiàn)出血點(diǎn)及死亡現(xiàn)象。

2.2 外周血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

外周血各項(xiàng)指標(biāo)中(表1)AA組WBC、PLT、RBC、HGB水平均明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。E838組與AA組相比，WBC高 163.8%，PLT高39.70%，RBC 高18.14%，HGB 高16.28%。

2.3 Ret計(jì)數(shù)

表1 E838對(duì)再障小鼠外周血的改善作用(±s，n=10)Tab.1 The therapeutic effect of E838 on peripheral blood of AA mice(±s，n=10)

表1 E838對(duì)再障小鼠外周血的改善作用(±s，n=10)Tab.1 The therapeutic effect of E838 on peripheral blood of AA mice(±s，n=10)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05;與AA組比較:2 P＜0.05Compared with control group:1 P＜0.05;Compared with irradiation group:2 P＜0.05

組 別 WBC/(109/L) RBC/(1012/L) HGB/(g/L) PLT/(109/L)Ret/‰對(duì)照組 6.30±0.36 8.74±0.98 145.0±12.1 1 016.4±88.1 86.2±10.7 AA 組 1.88±0.331 7.00±0.731 120.4±15.11 616.2±125.31 60.0±18.91 E838 組 4.96±0.212 8.27±1.172 140.0±20.6 860.8±94.72 140.5±24.12

經(jīng)煌焦油藍(lán)染色后鏡下可見(jiàn)(圖1)，AA組小鼠外周血Ret較對(duì)照組明顯減少，E838組Ret水平高于其余各組(表1)。油鏡下計(jì)數(shù)，AA組Ret比例較對(duì)照組低25.2%(P＜0.05)，E838組高于AA模型組134.2%(P＜0.05)。

圖1 E838對(duì)再障小鼠Ret改善作用(1 000×)Fig.1 The ameliorated effect of E838 on reticulocytes of AA mice(1 000× )

2.4 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

結(jié)果見(jiàn)表2，再障模型組較對(duì)照組低51.8%(P＜0.05)，E838 組高于AA 模型組134.2%(P＜0.05)。

2.5 病理學(xué)檢測(cè)

結(jié)果見(jiàn)圖2。骨髓石蠟切片HE染色鏡下觀察，AA組與對(duì)照組比較，骨髓增生低下，造血組織顯著減少，脂肪細(xì)胞增多，間質(zhì)水腫，血竇擴(kuò)張，有出血。E838組與AA比較，造血組織有所恢復(fù)，單核細(xì)胞增多，間質(zhì)水腫少見(jiàn)，沒(méi)有出血現(xiàn)象，脂肪細(xì)胞少于AA組。

表2 E838對(duì)AA小鼠骨髓單核細(xì)胞計(jì)數(shù)影響(±s，n=10)Tab.2 The ameliorated effect of E838 on BMMNCs of AA mice(±s，n=10)

表2 E838對(duì)AA小鼠骨髓單核細(xì)胞計(jì)數(shù)影響(±s，n=10)Tab.2 The ameliorated effect of E838 on BMMNCs of AA mice(±s，n=10)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05;與AA組比較:2P＜0.05Compared with control group:1P＜0.05;Compared with irradiation group:2P＜0.05

組 別 BMMNCs/(106/femur)對(duì)照組6.30±0.36 AA 組 1.88±0.331 E838 組 4.96±0.211，2

圖2 E838治療AA模型小鼠骨髓HE染色(100×)Fig.2 The HE staining of AA mice treated with E838(100× )

3 討論

目前對(duì)構(gòu)建AA動(dòng)物模型的評(píng)估方法通常參照臨床AA診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要包括:(1)全血細(xì)胞減少，Ret絕對(duì)值減少;(2)骨髓象三系造血細(xì)胞至少二系明顯減少;(3)骨髓造血組織明顯減少，脂肪組織增生［4-6］。在本研究中，建模第15天AA模型組小鼠外周血RBC、PLT、RBC、HGB和Ret較對(duì)照組顯著下降，符合建模要求。此外，骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓病理HE染色結(jié)果也符合臨床患者相關(guān)表現(xiàn)。綜合分析表明，我們研究中構(gòu)建的AA小鼠模型是成功的，進(jìn)行相關(guān)藥效學(xué)研究是可靠的。

在本研究中，E838組小鼠建模后灌胃給藥共14 d，第15天對(duì)小鼠各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)以驗(yàn)證E838是否具有治療作用。外周血各項(xiàng)指標(biāo)中，E838組WBC、RBC、PLT、Ret等指標(biāo)均明顯高于AA組(P＜0.05);其中Ret值提高明顯，并高于對(duì)照組(P＜0.05)，提示E838干預(yù)小鼠的RBC、HGB還將進(jìn)行性升高，骨髓單核細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓病理檢測(cè)均提示E838能有效恢復(fù)AA模型小鼠的造血組織機(jī)能。

據(jù)報(bào)道，有約70%AA患者免疫功能紊亂。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，AA患者外周血中Treg表達(dá)降低，分泌的細(xì)胞因子失衡，導(dǎo)致輔助性 T淋巴細(xì)胞Ⅰ型(Th1)數(shù)量增多，Thl/Th2比值升高，細(xì)胞免疫亢進(jìn)、自身免疫耐受打破;同時(shí)體內(nèi)Treg減少，抑制IL-2產(chǎn)生的能力下降，維持免疫耐受的能力降低，從而體內(nèi)自身活化性T細(xì)胞大量增殖，體液免疫亢進(jìn)，導(dǎo)致再障的發(fā)生。Polancayk等［7-8］研究發(fā)現(xiàn)在妊娠小鼠和經(jīng)雌二醇處理的小鼠體內(nèi)Foxp3表達(dá)加強(qiáng)，Treg細(xì)胞功能增強(qiáng)，其免疫抑制功能亦加強(qiáng);Tai等［9］發(fā)現(xiàn)生理劑量的雌二醇可以刺激CD4+CD25-T細(xì)胞向CD4+CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使不同組織中的Treg細(xì)胞增加，并增加Foxp3的表達(dá);研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD4+CD25-T細(xì)胞表面存在雌激素受體，而雌激素受體缺乏的動(dòng)物Foxp3水平降低。以上證據(jù)表明，雌激素可能通過(guò)上調(diào)Treg功能抑制細(xì)胞免疫和體液免疫，降低自身免疫介導(dǎo)的造血抑制，提示E838改善AA動(dòng)物模型造血功能可能是通過(guò)Treg介導(dǎo)的，但還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

在本項(xiàng)研究中，我們成功構(gòu)建了AA小鼠動(dòng)物模型，并利用這一模型研究了E838對(duì)AA模型小鼠造血功能的治療作用。我們推測(cè)E838對(duì)造血機(jī)能的恢復(fù)作用可能是由于其對(duì)Treg的上調(diào)而抑制了自身免疫介導(dǎo)的造血抑制，在今后的工作中我們將對(duì)這一假說(shuō)進(jìn)行研究，并研究其治療作用其他可能的機(jī)制，為開發(fā)AA治療藥物提供新的靶點(diǎn)。

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