艾旭 李昀 鄧沖 胡方靖 武軍駐

白藜蘆醇對肝癌Bel-7404細胞增殖、凋亡、侵襲影響機制研究

艾旭①②李昀①②鄧沖①②胡方靖①②武軍駐①

目的：觀察白藜蘆醇對肝癌Bel-7404細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，并研究其內在分子機制。方法：采用MTT法檢測白藜蘆醇對Bel-7404細胞增殖的影響；流式細胞術檢測白藜蘆醇對Bel-7404細胞凋亡的影響；Transwell法檢測白藜蘆醇對Bel-7404細胞侵襲的影響。結果：白藜蘆醇可以抑制Bel-7404細胞增殖，也可以誘導Bel-7404細胞凋亡，均呈濃度依賴性，與下調Procaspase3和PARP蛋白表達有關。白藜蘆醇可以抑制Bel-7404細胞侵襲性，呈濃度依賴性，與下調MMP-9、VEGF蛋白表達有關。結論：白藜蘆醇可以抑制肝癌Bel-7404細胞增殖，通過剪切Procaspase3、PARP蛋白而誘導凋亡，通過下調MMP-9和VEGF蛋白表達水平而抑制Bel-7404細胞侵襲性。

白藜蘆醇； 肝癌Bel-7404細胞； 增殖； 凋亡； 侵襲； 影響

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從葡萄、虎杖等植物內提取的一種多酚類化合物，其在抗炎、抗氧化、調節(jié)脂質代謝和改善微循環(huán)等方面都有一定的生物活性。而近年來多項研究顯示，白藜蘆醇在抗腫瘤治療和化學預防方面都顯示出一定的效果[1-3]。目前其在原發(fā)性肝癌的治療方面有一些研究，但其內在的抗腫瘤機制尚不明確[4-5]。本研究旨在觀察白藜蘆醇對肝癌Bel-7404細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，并探討其內在分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌Bel-7404細胞(中科院上海細胞庫)；白藜蘆醇、噻唑藍(MTT)(美國sigma公司)；新生牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；纖連蛋白(FN)和基底膜基質凝膠Matrigel(美國BD公司)；羊抗鼠Procaspase3，PARP，VEGF，MMP-9(美國Santa cruze公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 肝癌Bel-7404細胞在含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)， 取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT增殖檢測 將細胞用0.25%的胰酶消化，計數(shù)，制成2×105/ml的單細胞懸液，按照每孔100 μl接種與96孔板中，白藜蘆醇的最終濃度分別為25，50，100，200 μmol/L，分別在12、24、48 h孵育后換用不含血清的培養(yǎng)基每孔100 μl，避光條件下每孔加入MTT液10 μl(5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄去上清液，各孔加入DMSO100 μl，搖床震蕩10 min，酶標儀(Bio-Rad550型，美國Bio-Rad公司)檢測560 nm的OD值，取3孔平均值。實驗重復三次。抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4 細胞凋亡檢測 白藜蘆醇的最終濃度分別為0、25、 50、100 μmol/L孵育細胞48 h后，0.25%胰酶消化，1000 r/min離心，棄去上清液，用PBS洗一遍，離心得到細胞團。將細胞重懸于200 μl Binding Buffer，加入5 μl AnnexinV-FITC 和5 μl PI，4 ℃避光30 min，然后立即上流式機檢測(COULTER EPICS XL型，美國Beckman Coulter 公司)。

1.5 Transwell侵襲檢測 在Transwell小室濾膜的下室面鋪上FN并風干后，在小室上表面均勻鋪上1:3 RPMI1640稀釋的Matrigel，置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min使之凝固。取1×106/ml Bel-7404細胞 懸液(培養(yǎng)基為0.1% BSA的RPMI 1640)，加藥組Transwell小室的上室內加入白藜蘆醇(終濃度25 μmol，50 μmol/L)，下室內分別加入用上述培養(yǎng)基制成白藜蘆醇溶液600 μl，終濃度與上室內相同，各組設3復孔。培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h后取出濾膜，用甲醇固定，用棉簽擦去上內面內細胞，用結晶紫染色，隨機于顯微鏡下取5個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。以計數(shù)穿膜細胞數(shù)目來間接反映腫瘤細胞侵襲能力大小。

1.6 蛋白印跡實驗 收集各組處理細胞，每5×106細胞加入200 μl細胞裂解液，吹打并劇烈震蕩30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液于100 ℃、5 min變性，測蛋白濃度分裝備用，每孔上樣40 μg后電泳，恒流300 mA轉膜75 min，轉移后的PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后與1:1000鼠抗人MMP-9、Pro-caspase3、PARP-1、VEGF抗體4 ℃孵育過夜，而后加1:1000羊抗鼠抗體，室溫反應90 min，化學發(fā)光法檢測，暗室內壓片曝光，顯影后膠片用Genetools軟件分析灰度值。各目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值即為蛋白相對表達量。實驗重復三次。

1.7 統(tǒng)計學處理 所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對Bel-7404細胞增殖影響 白藜蘆醇可以明顯抑制Bel-7404細胞增值，呈濃度依賴性和時間依賴性。見圖1。

圖1 RES抑制Bel-7404細胞增殖

2.2 白藜蘆醇對Bel-7404細胞凋亡的影響 白藜蘆醇在孵育細胞48 h后可以誘導Bel-7404細胞凋亡，呈濃度依賴性。50 μmol/L和100 μmol/L 的濃度可以明顯誘導細胞凋亡(P<0.001)。見圖2。此外白藜蘆醇可以誘導Caspase-3酶原的激活，并剪切凋亡底物PARP-1，引起了凋亡的產(chǎn)生。

圖2 RES誘導Bel-7404細胞凋亡

2.3 白藜蘆醇對Bel-7404細胞侵襲能力的影響 白藜蘆醇可以在25 μmol/L 和50 μmol/L均可以明顯抑制細胞的侵襲能力，見圖3。并且MMP9和VEGF的蛋白水平表達也呈濃度梯度下降。

圖3 RES抑制Bel-7404細胞侵襲能力

3 討論

多項研究顯示，RES在致癌的三個主要階段均有化學預防、抗起始活性、抗促進和抗發(fā)展作用。最重要的是RES具有廣泛的抗腫瘤作用和化療、放療增敏作用。RES可以通過誘導多種凋亡通路的激活來實現(xiàn)抗腫瘤作用，筆者研究發(fā)現(xiàn)，RES可以誘導Bel-7404細胞凋亡，呈濃度依賴性，并伴隨著Procaspase3和PARP-1蛋白的激活、剪切。程海燕等[6]研究發(fā)現(xiàn)，RES可以通過激活Caspase3通路來誘導胰腺癌細胞的凋亡產(chǎn)生，這與筆者的研究結果一致。因此，筆者考慮RES是通過誘導Caspase3酶原激活、剪切，并引起凋亡的作用底物PARP-1的剪切而引起細胞凋亡發(fā)生的。Kuo等[7]研究指出，RES還可以通過P53依賴途徑在Hep G2細胞內誘發(fā)凋亡。至于P53途徑是否是RES在Bel-7404細胞誘導凋亡的依賴通路還有待進一步研究。

肝癌的復發(fā)、轉移與患者預后密切相關，而腫瘤血管生成又是促進癌癥復發(fā)、轉移必不可少的重要生物學過程之一。而VEGF是腫瘤新生血管形成的必要元素，它的表達可以作為評價腫瘤血管生成的一項指標。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族中的重要成員，主要功能是降解細胞外基質，是腫瘤細胞侵襲和細胞外基質重塑、腫瘤血管基底膜重塑的重要分子基礎，與腫瘤細胞的侵襲力密切相關，可以作為評價腫瘤細胞侵襲能力強弱的一項指標。趙占考等[8]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管MVD增高、MMP-2、MMP-9過度表達可能與肝細胞肝癌轉移、不良生存預后存在相關性。筆者的研究結果顯示，RES可以明顯降低Bel-7404細胞的侵襲能力，并伴隨VEGF和MMP-9蛋白的下調。Yu等[4]研究發(fā)現(xiàn)RES可以通過NF-kB信號通路減少Hep G2肝癌細胞VEGF的表達，從而有效地抑制裸鼠移植瘤的生長和血管生成。

目前抗腫瘤治療趨向于靶向治療和多藥聯(lián)合治療，因此，研究RES特定的分子機制將給未來肝癌的抗腫瘤治療提供精確地靶點，為聯(lián)合化療提供理論依據(jù)。

[1] Boddicker R L，Whitley E M，Davis J E，et al.Low-dose dietary resveratrol has differential effects on colorectal tumorigenesis in adiponectin knockout and wild-type mice[J].Nutr Cancer，2011，63(8):1328-1338.

[2] Huang X，Zhu H L.Resveratrol and its analogues:promising antitumor agents [J].Anticancer Agents Med Chem，2011，11(5):479-490.

[3] 張瑤，張淑蘭.白藜蘆醇對宮頸癌HeLa細胞表皮生長因子表達的影響[J].中國腫瘤臨床，2008，35(15):884-886.

[4] Yu H B，Zhang H F，Zhang X，et al.Resveratrol inhibits VEGF expression of human hepatocellular carcinoma cells through a NF-kappa B-mediated mechanism[J].Hepatogastroenterology，2010，57(102):1241-1246.

[5] 汪維佳，虞娉.白藜蘆醇增強順鉑對肝癌細胞Bel-7402的生長抑制作用[J].實用腫瘤雜志，2009，24(2):157-159.

[6] 程海燕，周家華，楊德同.白藜蘆醇誘導胰腺癌細胞凋亡通路的實驗研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學，2010，38(5):515-517.

[7] Kuo P L，Chiang L C，Lin C C.Resveratrol-induced apoptosis is mediated by p53-dependent pathway in Hep G2 cells[J].Life Sci，2002，72(1):23-34.

[8] 趙占考，孫保存，孫濤，等.肝細胞肝癌中微血管密度及MMP-2和MMP-9的表達與術后轉移及預后的關系[J].中國腫瘤臨床，2010，37(7):385-387.

10.3969/j.issn.1674-4985.2012.22.006

①武漢大學基礎醫(yī)學院 湖北 武漢 430060

②湖北省荊門市第一人民醫(yī)院

艾旭

2012-04-10) (本文編輯：連勝利)