具星愛(ài) 劉滋康 郭子寬 李占全

(1.遼寧省人民醫(yī)院 沈陽(yáng) 110016; 2.安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院院士工作站 合肥 230000;3. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京 100850)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)是一種成體干細(xì)胞,可誘導(dǎo)分化軟骨、骨骼、脂肪等多種組織,并且分泌多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子,如內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、白介素-4、白介素-10等,具有免疫調(diào)節(jié)功能。鑒于此,hMSC已被用于多種疾病的治療。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一種具有多種功能的細(xì)胞因子,可以促進(jìn)血管新生、肝臟修復(fù)、抑制細(xì)胞凋亡,還可以趨化外周血干細(xì)胞遷徙至組織修復(fù)部位。本研究針對(duì)hMSC用腺病毒介導(dǎo)的基因修飾HGF,并對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1 方法

1.1 骨髓hMSC的原代分離培養(yǎng)以及Ad-HGF轉(zhuǎn)染

取肝素抗凝的正常人骨髓5mL,用密度梯度離心法收獲單個(gè)核細(xì)胞層,按照2.0×105cells/cm2的密度接種細(xì)胞培養(yǎng)皿,以含10%FBS的α-MEM進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率為80%～90%時(shí),消化并傳代。培養(yǎng)hMSC至第三代,生長(zhǎng)匯合率達(dá)到70%～80%,在無(wú)血清培養(yǎng)體系中按照感染復(fù)數(shù)MOI=150pfu/細(xì)胞加入重組Ad-HGF的腺病毒顆粒。首先吸去培養(yǎng)上清,PBS洗滌培養(yǎng)瓶底面2遍后加入含Ad-HGF腺病毒顆粒的無(wú)血清α-MEM,體積為原先培養(yǎng)體積的一半。37℃,5%CO2和飽和濕度條件下孵育2h,加入相同體積的MSC完全培養(yǎng)基,使FBS的終濃度達(dá)到10%。繼續(xù)培養(yǎng)48h,收獲的細(xì)胞即為hMSC/Ad-HGF。按上述同樣方法,攜帶GFP基因的腺病毒載體(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染hMSC作為對(duì)照。

1.2 hMSC/Ad-HGF的鑒定

圖1 hMSC/Ad-HGF表面標(biāo)志物的鑒定

1.2.1 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)的鑒定 我們采用瑞士吉姆薩染色方法,對(duì)hMSC、hMSC/Ad-HGF進(jìn)行光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài),轉(zhuǎn)染Ad-GFP的hMSC形態(tài)則在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞表型的鑒定 第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hMSC/Ad-HGF,用0.1%胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù),每2.0×105個(gè)細(xì)胞分別與FITC或PE標(biāo)記的小鼠抗人CD31-PE,CD45-PE,CD34-PE,CD29-PE,CD14-PE,CD44-PE單克隆抗體避光孵育30min,流式細(xì)胞儀檢測(cè),WinMDI 2.9軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 培養(yǎng)上清HGF濃度的鑒定 利用ELISA方法,以hMSC和hMSC/Ad-GFP作為對(duì)照,對(duì)hMSC/Ad-HGF培養(yǎng)上清的HGF濃度進(jìn)行測(cè)定。將3組細(xì)胞均換成無(wú)血清α-MEM后繼續(xù)培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,抗原包被,HGF標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度(ng/mL):200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0,同時(shí)設(shè)空白調(diào)零孔,每稀釋度作5復(fù)孔,100μL/孔,4℃過(guò)夜。24h后,棄包被液,用1%BSA溶液封閉過(guò)夜,加入HGF抗體,100μL/孔,用封口膜封住反應(yīng)孔,37℃孵育60min。棄一抗,用加入二抗,每空100uL,37°孵育45min。用含0.05%Tween-20的PBS洗去未結(jié)合的抗體,3×5min;用OPDH2O2系統(tǒng)顯色,490nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染前后hMSC的形態(tài)學(xué)鑒定

光鏡下觀察形態(tài)結(jié)果,hMSC轉(zhuǎn)染前后均為成纖維樣細(xì)胞形態(tài),但是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖較快,細(xì)胞數(shù)量明顯增加,說(shuō)明轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子不會(huì)導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的改變,同時(shí)也可說(shuō)明轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子不會(huì)阻礙骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。通過(guò)熒光顯微鏡觀察,腺病毒感染后24h可見(jiàn)綠色熒光表達(dá),說(shuō)明腺病毒能夠有效感染原代MSC細(xì)胞,可以作為MSC基因治療的載體。

2.2 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞表型的鑒定

經(jīng)過(guò)基因修飾的hMSC是否表達(dá)原來(lái)的表型？本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞表型。如圖1所示,hMSC/Ad-HGF大小和顆粒度相對(duì)均一,表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原分子CD44和CD29,而不表達(dá)造血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物CD34,CD45,CD14和CD31,與hMSC的細(xì)胞表型完全一致。這說(shuō)明轉(zhuǎn)染Ad-HGF后hMSC細(xì)胞表面標(biāo)志物并沒(méi)有改變。

2.3 hMSC/Ad-HGF培養(yǎng)上清HGF濃度的鑒定

hMSC基因修飾Ad-HGF48h后,ELISA方法檢測(cè)HGF表達(dá)水平。結(jié)果hMSC/Ad-HGF的培養(yǎng)上清中HGF濃度達(dá)到(80.6±4.6)ng/mL,接近于對(duì)照組3.8倍。hMSC/Ad-HGF培養(yǎng)上清中HGF濃度顯著高于hMSC和hMSC/Ad-GFP組(P<0.001),而后兩者之間的HGF培養(yǎng)上清HGF濃度無(wú)顯著性差異。

3 討論

上世紀(jì)60年代Friedenstein A J等發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外貼壁培養(yǎng)形成集落,并在不同條件下可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌腱細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞等,具備多向分化潛能。MSCs具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

大鼠肝臟再生過(guò)程中,血漿內(nèi)存在一種與損傷肝臟的修復(fù)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)組分,稱為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子,HGF是目前進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段促血管形成細(xì)胞因子之一,可以促進(jìn)血管新生、肝臟修復(fù)、抑制細(xì)胞凋亡、還可以趨化外周血干細(xì)胞遷徙至組織修復(fù)部位。

本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后轉(zhuǎn)染Ad-HGF,首先從形態(tài)學(xué)證實(shí)Ad-HGF轉(zhuǎn)染不會(huì)導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化,不會(huì)阻礙hMSC的體外增殖。我們選取公認(rèn)的MSC特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定[6],hMSC/Ad-HGF大小和顆粒度相對(duì)均一,細(xì)胞較均一地表達(dá)CD44和CD29,而不表達(dá)CD31,CD34,CD45和CD14,說(shuō)明基因修飾前后的hMSC細(xì)胞表型沒(méi)有改變變。利用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清HGF濃度,結(jié)果轉(zhuǎn)染Ad-HGF后,hMSC培養(yǎng)上清中HGF濃度顯著增加,達(dá)到80ng/mL,接近轉(zhuǎn)染前的3.8倍,而轉(zhuǎn)入hMSC/Ad-GFP的培養(yǎng)上清中HGF濃度未有顯著性變化。

[1]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[J].Experimental Hematology,1976,4(5):267～274.

[2]Valtieri M,Sorrentino A.The mesenchymal stromal cell contribution to homeostasis[J].J Cell Physiol,2008,217:296～300.