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        PCR-熒光探針法檢測臨床痰標本結(jié)核分枝桿菌的可靠性研究

        2012-11-16 10:17:00梁建琴高華方李洪敏趙智賢張廣宇王金河王甦民劉佳文
        中國防癆雜志 2012年5期
        關鍵詞:探針核酸肺結(jié)核

        梁建琴 高華方 李洪敏 趙智賢 張廣宇 王金河 王甦民 劉佳文

        目前傳統(tǒng)的Mtb菌種鑒定和檢測方法如萋-尼染色、羅氏培養(yǎng)方法等,或靈敏度不高,易污染;或耗時長,易延誤診斷治療;或儀器設備昂貴,難于普遍開展。開發(fā)靈敏度高,耗時短,成本低廉易普及的檢測方法成為大勢所趨。而新近引入的PCR-熒光探針雜交技術(shù)靈敏度高、特異度高,成為研究的熱點。PCR-熒光探針雜交技術(shù)檢測臨床痰標本,有研究報道其特異度和靈敏度均達到理想的水平,且檢測快捷方便。本研究通過PCR-熒光探針法(博奧生物有限公司,分枝桿菌核酸檢測試劑)快速檢測和鑒別Mtb和非結(jié)核分枝桿菌(NT M),評價其在檢測臨床標本中Mt b的應用價值,有利于指導臨床開展早期有效的化療。

        材料和方法

        一、材料和試劑

        1.患者情況:2009年1月至2010年12月解放軍第三〇九醫(yī)院、北京市老年病醫(yī)院和北京結(jié)核病控制研究所門診或住院診斷明確的患者1015例,其中,男性763例,女性252例,年齡19~86歲,平均年齡(46.8±12.3)歲,住院患者收集晨痰,門診患者收集即時痰液,所有患者均做過痰涂片或培養(yǎng),結(jié)果見表1。其中非肺結(jié)核病患者痰標本274例,包括肺癌患者92例、支氣管哮喘患者59例、慢性支氣管炎患者102例,支氣管擴張患者21例,來源于解放軍第三〇九醫(yī)院165例和北京市老年病醫(yī)院109例;肺結(jié)核患者痰標本741例,其中解放軍第三〇九醫(yī)院158例、北京市老年病醫(yī)院279例和北京結(jié)核病控制研究所304例。肺結(jié)核的診斷標準符合參考文獻[1],其中菌陽(痰涂片或痰培養(yǎng)陽性)肺結(jié)核265例,菌陰肺結(jié)核476例。凡是該階段參與該研究的檢驗人員收集的痰標本均為納入對象,進行痰涂片和痰培養(yǎng);另有1名參與該研究的技師對收集的痰標本行PCR-熒光探針法檢測,并對對應患者的診斷進行追蹤,統(tǒng)計結(jié)果進行分組。

        2.菌株材料:分枝桿菌臨床分離株56株,其中解放軍第三〇九醫(yī)院29株;北京市老年病醫(yī)院14株;北京結(jié)核病控制研究所13株。其中1株為Mtb,55株為NT M。分枝桿菌標準菌株(ATCC 27294)由中國藥品生物制品檢定所提供。

        3.試劑:分枝桿菌核酸檢測試劑,博奧生物有限公司生產(chǎn);實時熒光定量PCR儀,型號ABI7700,由博奧生物有限公司提供。Mt b核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒(目前臨床上認可惟一同類產(chǎn)品)由中山大學達安基因股份有限公司提供。

        二、方法

        PCR具體操作步驟按照說明書進行。PCR結(jié)束后,根據(jù)樣品所在反應管內(nèi)熒光信號到達設定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)判斷是否存在Mt b或NT M,Ct值<40,為陽性。FA M(綠色)通道陽性,VIC(黃色)通道陰性,為 Mt b;FA M通道陽性,VIC通道陽性,為Mtb;FA M通道陰性,VIC通道陽性,為NT M;FA M通道陰性,VIC通道陰性,無分枝桿菌。試驗在解放軍第三〇九醫(yī)院、北京市老年病醫(yī)院和北京結(jié)核病控制研究所三家單位分別進行。操作者均是經(jīng)過博奧生物有限公司統(tǒng)一培訓的技術(shù)人員,結(jié)果由解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病研究所匯總形成研究總結(jié)報告。

        對臨床醫(yī)生需要檢測報告的226份標本進行了達安公司試劑盒檢測。

        對檢測結(jié)果與診斷不相符者、兩個試劑盒檢測結(jié)果不一致者、檢測結(jié)果為NT M者,擴增標本送檢50~100μl到上海生物工程有限公司進行16Sr DNA測序確認。

        三、評價項目

        統(tǒng)計靈敏度(包括菌陽靈敏度和菌陰靈敏度)、特異度、陽性預測值、陰性預測值等。并對該研究檢測結(jié)果和達安試劑盒(已經(jīng)上市)檢測結(jié)果進行χ2檢驗分析,判斷差異是否有統(tǒng)計學意義。

        四、評價方法

        為便于分析統(tǒng)計,按照臨床診斷、培養(yǎng)或涂片結(jié)果和PCR-熒光探針法結(jié)果分為6組(表1)。菌陽肺結(jié)核熒光探針法陽性組(A組),菌陽肺結(jié)核熒光探針法陰性組(D組),菌陰肺結(jié)核熒光探針法陽性組(B組),菌陰肺結(jié)核熒光探針法陰性組(C組),非肺結(jié)核熒光探針法陽性組(E組),非肺結(jié)核熒光探針法陰性組(F組)。三家醫(yī)院分別對各自醫(yī)院的標本同時進行達安試劑盒檢測,每個試驗都是一次性的結(jié)果。計算PCR-熒光探針法試劑盒靈敏度(包括菌陽靈敏度和菌陰靈敏度)、特異度、陽性預測值及陰性預測值。陽性預測值(%)=(真陽性例數(shù)/熒光探針法檢測陽性例數(shù))×100%,陰性預測值(%)=(真陰性例數(shù)/熒光探針法檢測陰性例數(shù))×100%。

        與達安公司試劑盒檢測結(jié)果進行陽性符合率、陰性符合率、總符合率的比較,采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,率的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        結(jié) 果

        一、PCR-熒光探針法直接檢測痰標本結(jié)果

        265例菌陽肺結(jié)核的痰標本,應用PCR-熒光探針法檢測出Mt b核酸陽性標本252例,檢測陽性率為95.1%(252/265),檢測出 NT M 核酸陽性標本5例,檢測陽性率1.9%(5/265),8例標本檢測為陰性,菌陽檢測靈敏度為97.0%(257/265);476 例菌陰肺結(jié)核的痰標本中,應用PCR-熒光探針法Mt b核酸陽性 110 例,檢出率為 23.1% (110/476),NT M 核酸陽性6例,檢出率為1.3%(6/476),菌陰肺結(jié)核標本檢測靈敏度為24.4%(116/476);274例非肺結(jié)核患者的痰標本中Mtb陽性標本3例,假陽性率為1.1%(3/274),3例痰標本經(jīng)16S r DNA 測序確認為結(jié)核分枝桿菌復合群。PCR-熒光探針法檢測痰標本分枝桿菌靈敏度為50.3%(373/741),特異度為98.9%(271/274),陽性預測值 99.2%(373/376),陰性預測值42.4%(271/639)。1015份臨床痰標本中共檢測出11份NT M核酸陽性標本(占1.1%),經(jīng) 16S r DNA 測序確認,準確率為100.0%。1015份痰標本統(tǒng)一編號,隨機數(shù)字量表法選取138份重復進行PCR熒光探針法檢測,結(jié)果一致率100.0%(表1)。

        二、PCR-熒光探針法檢測臨床分離株結(jié)果

        對56份臨床分離株進行檢測,1例Mt b核酸陽性,55例NT M核酸陽性,準確率100.0%。

        三、與達安公司試劑盒檢測比較結(jié)果

        與達安公司試劑盒比較,該研究檢測結(jié)果的陽性符 合 率 為 92.4% (122/132),陰 性 符 合 率 為98.9%(93/94),總體符合率為95.1%[(93+122)/226],經(jīng)卡方分析,χ2=2.98,P=0.226,兩種檢測方法之間差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

        與達安公司試劑盒比較,共有11例不符合標本,其中10例為臨床診斷肺結(jié)核患者標本。3例達安公司試劑盒檢測為Mt b陽性,博奧試劑盒檢測結(jié)果為NT M,16Sr DNA測序證實為NT M;1例為膿腫分枝桿菌,1例為戈登分枝桿菌,1例為偶發(fā)分枝桿菌。6例達安公司試劑盒檢測為Mtb,博奧檢測結(jié)果為分枝桿菌核酸陰性。1例博奧試劑盒檢測結(jié)果為Mt b核酸陽性,測序證實為Mt b,達安公司試劑盒檢測為陰性。另1例臨床診斷肺癌的標本,達安公司試劑盒檢測為Mt b核酸陽性,博奧試劑盒檢測結(jié)果為陰性。

        討 論

        目前由于熒光定量PCR技術(shù)同時具有特異性強、靈敏度高、定量準確、簡單易行等優(yōu)點,已經(jīng)被廣泛應用于 Mt b的檢測[2-3]。本研究采用PCR-熒光探針法(博奧生物有限公司分枝桿菌核酸檢測試劑盒)對1015例痰標本和56株臨床分離株進行檢測,檢測靈敏度為50.3%,特異度98.9%;并隨機抽取138例痰標本進行重復檢測,符合率100.0%。隨機選取226例標本,其中肺結(jié)核標本220例,6例非結(jié)核痰標本,與達安公司生產(chǎn)的Mt b檢測試劑盒就Mtb檢測項進行比較,該研究檢測結(jié)果的陽性符合率為92.4%,陰性符合率為98.9%,總體符合率為95.1%,經(jīng)統(tǒng)計分析(P=0.226),兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。由于部分患者痰液量較少和經(jīng)費不足等原因,本研究僅對臨床醫(yī)生需要檢測報告的226份標本進行了達安公司試劑盒檢測,下一步將開展PCR-熒光探針法檢測臨床痰標本的大樣本、多中心評價,目前兩種試劑盒對其余800余份培養(yǎng)分離株的檢測正在進行對比分析。

        臨床工作中,痰菌陰性,經(jīng)臨床綜合分析后診斷為肺結(jié)核的患者,約占臨床肺結(jié)核患者的60%~70%[4]。有報道指出痰菌陰性的肺結(jié)核患者,如果未經(jīng)過抗結(jié)核治療,經(jīng)過1~3年的隨訪,將有40%~60%的患者發(fā)展為菌陽甚至更為典型的肺結(jié)核。所以,獲得病原學診斷至關重要。本研究利用博奧公司分枝桿菌核酸檢測試劑盒對476例臨床診斷菌陰肺結(jié)核患者的痰標本進行檢測,檢測出Mt b核酸陽性110例,NT M核酸陽性6例,菌陰肺結(jié)核標本檢測靈敏度為24.4%(116/476)。目前 PCR-熒光探針法直接用于菌陰肺結(jié)核痰標本檢測的報道較少,肖海浩等[5]應用抗酸染色涂片、Mt b培養(yǎng)、熒光定量PCR和噬菌體生物擴增4種方法對68例菌陰肺結(jié)核患者的支氣管灌洗液進行檢測,陽性率分別為29.4%、54.4%、33.8%和14.7%,認為灌洗液涂片和熒光定量PCR對菌陰肺結(jié)核快速診斷具有重要的臨床應用價值。與本研究結(jié)果類似,提示PCR-熒光探針法可以作為臨床痰涂片和痰培養(yǎng)的補充,為臨床診斷和治療提供幫助。

        表1 各組PCR-熒光探針法直接檢測痰標本結(jié)果

        表2 博奧試劑盒與達安公司試劑盒檢測Mtb結(jié)果的比較(例)

        許多分枝桿菌16S r DNA序列是高度保守的,只在某些位置上存在少許核苷酸變化,這些核苷酸變化的位置是分枝桿菌屬或種特異的,已經(jīng)普遍用于分枝桿菌的菌種鑒定工作中[6]。本研究中應用PCR-熒光探針法檢測出11例NT M核酸陽性標本(1.1%),經(jīng)16Sr DNA 測序確認,準確率100.0%;對56株臨床分離株(1株Mt b臨床分離株,55株NT M臨床分離株)檢測,檢測準確率100.0%。與達安公司試劑盒相比,有11例不符合標本,在10例臨床診斷為肺結(jié)核患者的標本中,達安公司試劑盒3例檢測為Mt b陽性的標本,博奧檢測結(jié)果為NT M,并經(jīng)16Sr DNA測序證實為NT M;另外7例中6例達安公司試劑盒檢測為Mt b,博奧檢測結(jié)果為分枝桿菌核酸陰性,1例博奧試劑盒檢測結(jié)果為Mtb核酸陽性,達安公司試劑盒檢測為陰性,可能因為痰液處理過程中核酸丟失出現(xiàn)的假陰性,或是操作過程中污染而呈現(xiàn)假陽性。274例非肺結(jié)核患者的痰標本,應用PCR-熒光探針法檢測出Mtb核酸陽性標本3例,假陽性率為1.1%(3/274),3例痰標本經(jīng)16S r DNA測序確認為結(jié)核分枝桿菌復合群,其中1例臨床診斷為肺癌患者(病理證實為腺癌),用達安試劑盒檢測Mtb核酸陽性,判斷該患者同時合并Mtb感染;另外2例均為支氣管擴張患者,追蹤患者病史和肺部CT,考慮2例患者不能排除結(jié)核性支氣管擴張或者是合并Mtb感染的可能,需進一步追蹤明確。

        目前,已有大樣本結(jié)果顯示痰液熒光定量PCR檢測可獲得比涂片鏡檢明顯高的陽性率和略高于培養(yǎng)的陽性率,省時快速,是一種快速、敏感度高、特異度高的 Mtb輔助診斷方法,具有重要的應用價值[7-8]。2010年賀松[9]的 Meta分析認為,從現(xiàn)有的臨床證據(jù)來看,熒光定量PCR是檢測Mtb的有效方法,可推廣應用于臨床結(jié)核病輔助檢測。與本研究結(jié)果一致。

        以上分析表明,PCR-熒光探針法檢測Mt b和NT M簡便可行,耗時短(僅需1 d時間),檢測靈敏度(50.3%)、特異度(98.9%)與抗酸染色(10%、30%)和培養(yǎng)法(30%、40%)相比[10-12],靈敏度大大提高。本研究發(fā)現(xiàn),博奧生物有限公司分枝桿菌核酸檢測試劑與目前常用的達安公司檢測試劑盒相比,結(jié)果具有一定的可靠性,且同時可檢測和鑒別Mtb與NT M,國內(nèi)外未見類似報道。在臨床上可先行PCR-熒光探針法進行初篩,對確定為NT M感染的患者可再進一步行基因芯片雜交分析,可將分枝桿菌鑒定至種,經(jīng)濟實用,縮短了檢測時間,對指導臨床意義重大。

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