謝 翎，陳紅梅，楊吉彬，黃 勃

（1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶246011；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036；3.安慶龍麟農(nóng)業(yè)生態(tài)博覽園發(fā)展有限公司，安徽安慶246003）

卷心菜中葉黃素提取工藝研究

謝 翎1，2，陳紅梅1，楊吉彬3，黃 勃2，*

（1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶246011；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036；3.安慶龍麟農(nóng)業(yè)生態(tài)博覽園發(fā)展有限公司，安徽安慶246003）

采用超聲波輔助提取卷心菜中的葉黃素，高效液相色譜法檢測(cè)葉黃素含量。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定卷心菜中葉黃素的最優(yōu)工藝條件為：丙酮為提取劑，超聲波功率為500W，超聲提取時(shí)間為30min，料液比為1∶30，提取溫度為60℃。卷心菜干粉中葉黃素含量約為5.6mg/100g。研究結(jié)果對(duì)葉黃素的生產(chǎn)與商業(yè)化應(yīng)用將具有重要意義。

卷心菜，高效液相色譜法，葉黃素，超聲波

圖1 全反式異構(gòu)體葉黃素分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of trans isomer lutein

葉黃素（lutein）是一種天然色素，又稱植物黃體素，屬于“類胡蘿卜素”類物質(zhì)，最早是由Wihelm與Wackenroder兩位科學(xué)家于1831年發(fā)現(xiàn)的[1]。葉黃素分子量為568.9，其分子碳架，主要由兩個(gè)六元環(huán)和一個(gè)多聚烯鏈共同組成。雖然，在理論上葉黃素有多種同分異構(gòu)體，但自然條件下葉黃素主要還是以全反式異構(gòu)體的形式存在[2]（圖1）。由于具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、安全無(wú)毒、富含營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn)，葉黃素越來(lái)越受到人們的重視，從而在食品、保健品及醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛的應(yīng)用。隨著對(duì)葉黃素相關(guān)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)葉黃素其實(shí)是一種優(yōu)良的抗氧化劑[3]，在預(yù)防年齡相關(guān)性視黃斑退化[4-5]，降低結(jié)腸癌發(fā)病率[6]，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生等方面有著顯著的效果。目前，國(guó)際上對(duì)葉黃素的需求量日益增大，價(jià)格不斷提升。因此，研究開(kāi)發(fā)新的具有潛力的葉黃素植物源具有重要的商業(yè)價(jià)值。卷心菜（Brassica oleracea L.var. capitata L.），又名球甘藍(lán)，屬于甘藍(lán)的變種，我國(guó)各地都有栽培。卷心菜口味清香，脆嫩，四季都能吃到，是主要的蔬菜品種之一。近年，西方一些國(guó)家的學(xué)者們發(fā)現(xiàn)它在抗衰老和防止心腦血管疾病、癌癥等方面顯現(xiàn)了奇異功效[7]。卷心菜在我國(guó)的產(chǎn)量非常高，且價(jià)格較低。通過(guò)卷心菜來(lái)提取葉黃素是一種非常理想的選擇。本研究就是在前人工作的基礎(chǔ)上，探索和優(yōu)化卷心菜葉黃素提取工藝。由于常規(guī)葉黃素提取都是通過(guò)皂化方法，工藝較為復(fù)雜；本文采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取卷心菜中葉黃素，旨在獲得卷心菜中葉黃素的高效能提取法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卷心菜 購(gòu)于本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，葉片洗凈后切碎，經(jīng)24h凍干后粉碎，卷心菜干粉用于后續(xù)葉黃素提?。ň硇牟烁煞劭蛇^(guò)50目篩）；葉黃素標(biāo)樣 德國(guó)Sigma公司；丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿 均為國(guó)產(chǎn)分析純；甲醇 國(guó)產(chǎn)色譜純。

Waters600高效液相色譜儀、分析型色譜柱（5μm，4.6×250mm，ODS2） 美國(guó)Waters公司；FreeZone12冷凍干燥系統(tǒng) 美國(guó)Labconco公司；SENCO R-502旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申勝生物技術(shù)公司；KH5200DB超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取液的確定 由于葉黃素易溶于二氯化碳、氯仿以及酯類。因此選取二氯化碳、氯仿、乙酸乙酯，以及常用有機(jī)試劑丙酮作為候選萃取液，以篩選合理的葉黃素提取溶劑。

精確稱量5.0g卷心菜干粉，分別用二氯化碳、氯仿、乙酸乙酯以及丙酮定容至100mL，在超聲波清洗器中400W功率下振蕩60min（振動(dòng)處理溫度50℃）。振蕩結(jié)束后，對(duì)樣品在5000×g下離心5min。將澄清提取液旋轉(zhuǎn)蒸干后，統(tǒng)一用丙酮定容至10mL。樣品再次在5000×g下離心5min，進(jìn)HPLC檢測(cè)。另外，用丙酮分別配制葉黃素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液5、10、20、50、100μg/mL。

1.2.2 超聲波振動(dòng)功率的確定 稱取卷心菜干粉5.0g，用丙酮定容至100mL，分別在200、300、400、500、600W功率的超聲波下振動(dòng)60min（振動(dòng)處理溫度50℃）。振蕩結(jié)束后，對(duì)樣品離心。將澄清提取液濃縮后，用丙酮定容至10mL。樣品再次離心后，進(jìn)HPLC檢測(cè)。

1.2.3 超聲波振動(dòng)時(shí)間的確定 稱取卷心菜干粉5.0g，用丙酮定容至100mL，50℃下分別在超聲波500W下振動(dòng)10、30、60、90、120min（振動(dòng)處理溫度50℃）。振蕩結(jié)束后，對(duì)樣品離心。將澄清提取液濃縮后，用丙酮定容至10mL。樣品再次離心后，進(jìn)HPLC檢測(cè)。

1.2.4 料液比的確定 稱取卷心菜干粉5.0g，分別用25、50、100、150、200mL丙酮定容，50℃下在超聲波500W下振動(dòng)30min（振動(dòng)處理溫度50℃）。振蕩結(jié)束后，對(duì)樣品離心。將澄清提取液濃縮后，用丙酮定容至10mL。樣品再次離心后，進(jìn)HPLC檢測(cè)。

1.2.5 超聲波處理溫度的確定 稱取卷心菜干粉5.0g，用150mL丙酮定容，分別于40、50、60、70℃用超聲波500W功率振動(dòng)30min。振蕩結(jié)束后，對(duì)樣品離心。將澄清提取液濃縮后，用丙酮定容至10mL。樣品再次離心后，進(jìn)HPLC檢測(cè)。

1.2.6 液相色譜條件 Waters高效液相色譜儀，檢測(cè)波長(zhǎng)446nm，色譜柱ODS2反向C18柱，柱溫25℃，色譜時(shí)間20min，平衡時(shí)間5min，流動(dòng)相為純甲醇（流速0.5mL/min），進(jìn)樣量20μL。所有樣品檢測(cè)處理，均重復(fù)三次。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 HPLC峰面積表達(dá)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用DUCAN多重比較法[8]進(jìn)行多個(gè)均數(shù)間兩兩比較。數(shù)據(jù)分析均使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件[9]。

1.2.8 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，繼續(xù)選擇超聲波處理功率、處理時(shí)間、處理溫度及料液比為考察因素，以葉黃素HPLC檢測(cè)出峰面積為指標(biāo)，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1），優(yōu)化出卷心菜中葉黃素提取的最佳工藝參數(shù)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)葉黃素標(biāo)樣進(jìn)HPLC所得峰面積，在濃度5～100μg/mL范圍內(nèi)，以葉黃素濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：y=548.4x+711.76，R2=0.9992。通過(guò)各處理樣品與標(biāo)樣出峰時(shí)間對(duì)比，可以確定在4min左右所出峰為同一物質(zhì)，即葉黃素。將各樣品峰面積代入上述回歸方程，即可獲得卷心菜干粉中葉黃素含量。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取試劑的確定 從表2可以看出，用丙酮作為提取溶劑提取的葉黃素量最多，其次為二氯甲烷和氯仿，乙酸乙酯提取量最低，且差異極顯著。

表2 不同溶劑處理對(duì)卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 2 Effect of solvents on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.2 超聲波振動(dòng)功率的確定 選擇丙酮作為提取溶劑，在不同的超聲波功率處理下振蕩60min。從表3可以看出，隨著超聲波振動(dòng)功率的上升，在60min內(nèi)葉黃素的出峰面積呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)。200W時(shí)，葉黃素的出峰面積最小，只有7537.48mAU。當(dāng)超聲功率升到500W，峰面積達(dá)到最大值，為13573mAU。當(dāng)超聲波功率超過(guò)500W繼續(xù)上升時(shí)，葉黃素的出峰面積開(kāi)始降低。方差分析表明，各處理出峰面積差異極顯著。

2.2.3 超聲波振動(dòng)時(shí)間的確定 選擇丙酮作為提取溶劑，在500W超聲波功率處理下振蕩不同時(shí)間。從表4可以看出，超聲處理30min時(shí)，葉黃素的出峰面積保持在最大值13536mAU。方差分析表明，超聲處理30min與60min峰面積差異不明顯。另外，當(dāng)超聲處理超過(guò)60min后，葉黃素的出峰面積明顯開(kāi)始下降。當(dāng)振蕩2h后，葉黃素的出峰面積下降至12182mAU。

表3 不同功率的超聲振蕩對(duì)卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of lutein from cabbage

表4 不同時(shí)間超聲處理對(duì)卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.4 料液比的確定 選擇不同體積的丙酮作為提取溶劑，取5g凍干卷心菜粉，在500W超聲波功率處理下振蕩30min。從表5可以看出，5g干粉選用150mL丙酮抽提時(shí)（即料液比為1∶30），其平均葉黃素出峰面積最大，為15226mAU。方差分析表明，料液比為1∶30與1∶40時(shí)葉黃素出峰面積差異極不明顯，說(shuō)明繼續(xù)增加溶劑量可能已無(wú)法提高葉黃素的抽提效率。

表5 不同料液比處理對(duì)卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 5 Effect of solid to liquid ratio on extraction yield of lutein from cabbage

表6 不同溫度處理對(duì)卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 6 Effect of temperature during ultrasonic on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.5 超聲處理溫度的確定 選擇150mL的丙酮作為提取溶劑，取5g凍干卷心菜粉，在500W超聲波功率處理下，于不同溫度下用超聲波500W功率振蕩30min。從表6可以看出，方差分析說(shuō)明50℃與60℃下處理時(shí)，峰面積數(shù)據(jù)差異并不明顯。但60℃下抽提時(shí)，其平均葉黃素峰面積與葉黃素提取平均值都高于50℃處理。因此，后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)應(yīng)對(duì)溫度處理?xiàng)l件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)提取試劑為丙酮時(shí)，超聲振動(dòng)功率、超聲振動(dòng)時(shí)間、料液比、處理溫度對(duì)卷心菜干粉中葉黃素的提取量都具有影響。為尋求最佳工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，選取超聲振動(dòng)功率、振動(dòng)時(shí)間、料液比和處理溫度為考察因素，以葉黃素提取量為指標(biāo)，取三水平按L9（34）設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。

表7表明，極差RB＞RC＞RD＞RA。極差越大，該因素水平變動(dòng)時(shí)，單位材料中葉黃素提取量變化越大。即因素B（超聲作用時(shí)間）對(duì)葉黃素提取量影響最大，其次是因素C（料液比），因素D（提取溫度）次之，因素A（超聲功率）對(duì)提取量影響最小。

表7 卷心菜葉黃素提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Orthogonal array matrix and experimental results

以葉黃素提取量為指標(biāo)，進(jìn)行方差分析。表8方差分析顯示，F(xiàn)A＜FD＜FC＜FB＜F0.05=4.460，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)選取各因素對(duì)葉黃素提取量的影響均表現(xiàn)為不顯著。

表8 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 8 Variance analysis for extraction yield of lutein with various extraction conditions

結(jié)合表7與表8可以得出，采用丙酮為提取試劑，卷心菜干粉中葉黃素的最佳提取工藝條件為超聲功率500W，超聲處理時(shí)間30min，料液比1∶30，處理溫度60℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，卷心菜干粉中葉黃素含量約為：5.6mg/100g。

3 討論與結(jié)論

葉黃素是自然界中一種重要生物活性物質(zhì)，它在食品與保健品生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的作用。能夠從低價(jià)的食物源原料中，通過(guò)簡(jiǎn)單易行的方法提取葉黃素，并進(jìn)行精確定量定性分析，是目前葉黃素產(chǎn)業(yè)化研究的熱點(diǎn)。本研究以國(guó)內(nèi)產(chǎn)量巨大且價(jià)格偏低的常見(jiàn)蔬菜－卷心菜為材料，探索了葉黃素經(jīng)濟(jì)可行的新的提取方法和原料來(lái)源。

對(duì)于葉黃素的分析和檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外之前已經(jīng)有很多的方法，例如：薄層層析法（TLC）、分光光度法等[10]。由于TLC分析效果較差，且無(wú)法對(duì)產(chǎn)物精確定量。而分光光度法則對(duì)單一葉黃素測(cè)定結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定偏差[11]。因此，人們迫切希望能探索出精確分析葉黃素的新方法。近些年來(lái)，發(fā)展起來(lái)的HPLC就是一種精確的物質(zhì)分析技術(shù)。由于其試劑消耗少、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，因此在植物組織活性物質(zhì)分離分析方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[12-13]。所以，HPLC技術(shù)也是目前葉黃素提取工藝研究中較為理想的產(chǎn)物分析方法[14-15]。

我們通過(guò)有機(jī)試劑的直接強(qiáng)化提取，并借助超聲波處理，簡(jiǎn)化了常規(guī)的葉黃素皂化提取分離工藝。結(jié)果表明，通過(guò)丙酮萃取抽提，在優(yōu)化了超聲波處理等條件后，卷心菜中的葉黃素能夠高效率的被提取出來(lái)。每100g卷心菜干粉中，能獲得5.6mg左右的葉黃素。

從研究結(jié)果中，我們也發(fā)現(xiàn)超聲波的生物學(xué)效應(yīng)十分復(fù)雜，不同的作用條件下其生物學(xué)作用是不同的。雖然理論上，提取時(shí)間越長(zhǎng)，樣品破碎越充分，則細(xì)胞中內(nèi)含物被抽提的效率將會(huì)越高。但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在超聲波萃取葉黃素的過(guò)程中，在抽提一定時(shí)限后，即可將絕大多數(shù)水溶性成分提出。過(guò)多地延長(zhǎng)提取時(shí)間，不僅破碎效率不會(huì)相應(yīng)提高，甚至?xí)?duì)已生成的產(chǎn)物有破壞作用。另外，料液比合適時(shí)也可以提高葉黃素的產(chǎn)量，并減少不必要的浪費(fèi)。

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Study on extraction technology of lutein from cabbage

XIE Ling1，2，CHENG Hong-mei1，YANG Ji-bin3，HUANG Bo2，*
（1.School of Life Science，Anqing Teachers College，Anqing 246011，China；2.Anhui Provincial Key Laboratory for Microbial Pest Control，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；3.Anqing Long Ling Agro-ecological Exposition Development Co.，Ltd.，Anqing 246003，China）

Lutein from cabbage was extracted by ultrasonic，and the production was determined by HPLC.The extraction process was optimized by the orthogonal-array-design on the basis of a series of single-factor experiments.Experimental results showed that the optimal condition was as follows：acetone as extraction solvent，the power of ultrasonic 500W，treatment time of ultrasonic 30min，the extraction ratio of solid to liquid 1∶30，extraction temperature 60℃.Under the optimum conditions，about 5.6mg lutein could be extracted from 100g dried powder of cabbage.This experimental conclusion had great significance for production and commercial application of lutein.

cabbage；high performance liquid chromatography；lutein；ultrasonic

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0269-04

2011－10－17 *通訊聯(lián)系人

謝翎（1980-），男，講師，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)項(xiàng)目（KJ2010B091）；安慶市重點(diǎn)科技項(xiàng)目（20100808）；安慶師范學(xué)院科研啟動(dòng)項(xiàng)目（044-K05000000281）。