高學玲，賀曼曼，岳鵬翔，鄒敏亮，查芳芳

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036；2.黃山天健農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽黃山245700）

黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜研究

高學玲1，賀曼曼1，岳鵬翔1，鄒敏亮2，*，查芳芳1

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036；2.黃山天健農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽黃山245700）

為建立黃山貢菊揮發(fā)油指紋圖譜分析方法，采用GC-MS檢測法并運用指紋圖譜相似度評價軟件對其結果進行分析。結果表明，采用HP-5MS毛細管色譜柱（0.25mm×30m×0.25μm），設置進樣口溫度為260℃，載氣為高純氦氣，流速1.0mL·min-1，分流比為25∶1，進樣量2μL的條件，以程序升溫對10批黃山貢菊揮發(fā)油成分進行分析，標定了黃山貢菊揮發(fā)油的59個共有峰為特征峰，初步建立了以59個共有峰為特征指紋信息的GC-MS指紋圖譜，10批樣品相似度均大于0.9；質(zhì)譜鑒定出黃山貢菊揮發(fā)油含量最高成分為Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate，約占總量的20%。此分析方法精密度高、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好，揮發(fā)油中各成分分離效果較好，所建立的指紋圖譜可為黃山貢菊質(zhì)量控制提供參考，且上述含量最高的成分可作為黃山貢菊指標性成分之一來控制黃山貢菊質(zhì)量的穩(wěn)定性。

黃山貢菊，揮發(fā)油，氣-質(zhì)聯(lián)用儀，指紋圖譜

菊花（Floschrysanthemi） 為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）的頭狀花序，多年生草本植物，隨品種及產(chǎn)地不同分為貢菊、杭菊、亳菊、滁菊、懷菊、濟菊等。黃山貢菊是主產(chǎn)黃山歙縣金竹嶺地區(qū)的地道藥材，具有味甘苦、性微寒、疏風清熱、平肝明目、解毒消腫的功效，主治風熱感冒、發(fā)熱頭痛、眩暈、目赤腫痛、疔瘡腫痛等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃山貢菊含有黃酮類、綠原酸、木犀草素以及揮發(fā)性成分等[2-3]，具有抗菌、抗氧化、解熱、降壓、抑制突變、抗癌等作用[4-9]。黃山貢菊作為中國藥典收藏的四大藥菊之一，品質(zhì)優(yōu)良，集色、香、味、型于一體，既有觀賞價值，又有藥用功能，被譽為藥用和飲中之佳品。近些年，由于黃山貢菊市場價格較高，很多商人用當?shù)厮a(chǎn)七月菊充當黃山貢菊，從而對黃山貢菊的質(zhì)量穩(wěn)定帶來了極大影響。目前對黃山貢菊的鑒定及品質(zhì)評價多依賴于感官審評，還缺乏必要的理論依據(jù)。指紋圖譜是現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制的重要手段之一，目前，關于菊花揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜研究，僅見少量文獻報道[10-11]，尚未見到關于黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的研究報道。本實驗依據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄XD“揮發(fā)油測定法”項下甲法提取菊花中揮發(fā)油方法，運用GC-MS法對其揮發(fā)油指紋圖譜進行研究，以期為黃山貢菊質(zhì)量標準的建立及品質(zhì)控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃山貢菊 黃山歙縣雅氏貢菊廠提供，由安徽歙縣農(nóng)業(yè)委員會畢小衛(wèi)主任鑒定，樣品來源信息見表1；龍腦（純度99.2%）、樟腦（純度≥96%） 中國藥品生物制品檢定所；正己烷 分析純，青島匯和化工。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 7890-5975C型，美國安捷倫有限公司；電子天平 AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司。

表1 菊花樣品來源信息Table 1 Sources of Flos chrysanthemi samples

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 GC：HP-5MS毛細管色譜柱（0.25mm× 30m×0.25μm）；進樣口溫度：260℃；升溫程序：初始溫度80℃，以2℃·min-1升至100℃保持20min，再以1℃·min-1升至135℃，再以5℃·min-1升至250℃，保持10min；載氣為高純氦氣，流速1.0mL·min-1；恒流，分流比：25∶1；進樣量：2μL。MS：EI源（70eV），雙燈絲，離子源溫度230℃；四極桿溫度：150℃；溶劑延時3min；質(zhì)量范圍m/z：50～500全程掃描。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取龍腦8.6mg，樟腦13.0mg，分別用正己烷定容至10mL容量瓶中；各吸0.1mL，加正己烷1.8mL，配成43、68mg/L的混標溶液。

1.2.3 供試品制備 供試樣粉碎后（過24目），精密稱取100g，1200mL超純水裝入5000mL圓底燒瓶，連接揮發(fā)油測定儀，接上冷凝管，自冷凝管上端加水至溢入圓底燒瓶，電爐上加熱保持微沸6h，停止加熱，靜置分層后，用2mL正己烷收集揮發(fā)油，濾頭過濾后上機檢測。

1.2.4 方法學考察 精密度實驗（取同一份供試樣，連續(xù)進樣6次）；穩(wěn)定性實驗（取同一份供試樣，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24h進樣）；重復性實驗（稱取同一份樣6份，分別在同樣條件下提取進樣分析），以樟腦峰為參照物，計算各特征峰相對保留時間及相對峰面積的RSD。

2 結果與討論

2.1 方法學考察結果

通過精密度、穩(wěn)定性、重復性實驗考察，結果表明各特征峰的相對保留時間RSD均小于2%，相對峰面積RSD小于5%，符合指紋圖譜要求。

2.2 指紋圖譜的建立及分析

以安徽歙縣金竹嶺地區(qū)所產(chǎn)的黃山貢菊為研究對象，對10批藥材的揮發(fā)性成分進行測定，10批樣品揮發(fā)油的GC-MS疊加圖譜見圖1。由圖1可知，黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS色譜可分離100多個峰，將10批黃山貢菊的指紋圖譜進行匹配，結果有59個共有特征峰（占總峰面積的約90%），以樟腦峰為參照峰，分別求出各特征峰的調(diào)整保留時間之比及相對峰面積，采用GC-MS聯(lián)用技術，通過NIST2008標準質(zhì)譜圖庫檢索，標準品對照，并結合有關文獻，鑒定了45個共有峰，其結果見表2。

圖1 10批黃山貢菊GC-MS色譜指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprints of ten batches of Gongju

根據(jù)表2標定20個已鑒定出相對含量較高的峰為較強峰，分別為：峰1、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10、峰11、峰12、峰13、峰14、峰15、峰17、峰18、峰25、峰27、峰38、峰39、峰58，此外還有常見報道的峰3、峰4；其余的為次強峰。由譜圖及以上數(shù)據(jù)可以看出較強峰大部分在60min以前出現(xiàn)，出峰時間較穩(wěn)定且相對含量較高，約占總共有峰面積的80%左右，分離效果較好，可體現(xiàn)黃山貢菊的特有香氣，其中峰6為突出指標；次強峰的相對含量較小，分離度次于較強峰；對于未鑒定出的其它共有未知峰還有待于進一步研究確定。從相對峰面積可以看出，不同批次樣品同一色譜峰存在差異，這可能與單批藥材的具體產(chǎn)地及炮制工藝等有關。

由表2可知，黃山貢菊的香氣類成分主體上屬于萜稀類，如Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate、乙酸冰片酯、β-欖香稀、石竹烯、金合歡稀、大牦牛兒稀D、芳-香姜黃稀、姜倍半萜、紅沒藥烯、倍半水芹稀、匙葉桉油稀醇、石竹稀氧化物、樟腦、龍腦等。

2.3 指紋圖譜相似度分析

表2 10批次黃山貢菊揮發(fā)油特征峰相對含量Table 2 Relative area of common peaks in ten batches of Gongju

對10批黃山貢菊揮發(fā)油GC-MS圖譜進行相似度分析，并以第1批黃山貢菊揮發(fā)油的圖譜作為參照譜圖，將10批黃山貢菊揮發(fā)油圖譜作為代表性圖譜生成共有模式見圖2，計算10批黃山貢菊及其他品種菊花與共有模式之間的相似度，結果見表3。

續(xù)表

圖2 黃山貢菊揮發(fā)油共有峰指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of common peaks of Gongju essential oil

表3 與共有模式比較的各樣品相似度評價Table 3 Evaluation of similarity of Gongju

由表3可以看出，10批黃山貢菊的相似度均在0.9以上，符合國家藥品監(jiān)督管理局對指紋圖譜相似度要求。在相同提取及色譜條件下，將其它種類菊花揮發(fā)油圖譜與黃山貢菊揮發(fā)油指紋圖譜進行相似度分析，結果發(fā)現(xiàn)由于產(chǎn)地、氣候、土壤條件、炮制工藝及品種的不同，其揮發(fā)油成分與黃山貢菊差異較大，因此此方法可將黃山貢菊與其他種類菊花區(qū)別開，從而有效保證黃山貢菊的質(zhì)量穩(wěn)定。

3 結論

利用GC-MS分析黃山貢菊揮發(fā)油成分，標定了59個共有峰構成黃山貢菊揮發(fā)油特征峰指紋圖譜，其峰面積占總峰面積約90%，符合指紋圖譜的要求。

黃山貢菊揮發(fā)油成分與其它地區(qū)不同品種菊花揮發(fā)油成分有一定的差別，黃山貢菊揮發(fā)油中含量最高的成分是Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethylaceate，約占20%，其它地區(qū)貢菊及其它品種菊花中該揮發(fā)油成分含量則較低（10%以下），因此，Bicyclo[3.1.1] hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate可作為黃山貢菊指標性成分之一來控制黃山貢菊質(zhì)量的穩(wěn)定性。

指紋圖譜是國際公認的控制中藥質(zhì)量的有效手段之一，本文通過氣質(zhì)聯(lián)用色譜法建立了黃山貢菊揮發(fā)油指紋圖譜，對揮發(fā)油的主要成分進行了分析鑒定，為黃山貢菊的質(zhì)量評價和后期的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

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GC-MS fingerprint analysis of volatile oil in Gong Chrysanthemum morifolium in Huangshan City

GAO Xue-ling1，HE Man-man1，YUE Peng-xiang1，ZOU Min-liang2，*，ZHA Fang-fang1
（1.School of Tea and Food Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；2.Huangshan Tianjian Agricultural Sci-Tech Ltd.，Huangshan 245700，China）

To establish a method of fingerprint analysis on Gong Chrysanthemum morifolium in Huangshan City by using GC-MS and computer aided similarity evaluation.The results showed that the optimum condition of GC-MS was applied with a fiber column（0.25mm×30m×0.25μm）coated with HP-5MS.The temperature at feed inlet was 260℃，the carrier gas was nitrogen，the flow rate was 1.0mL·min-1，the split ratio was 25∶1，and the sample size was 2μL.The essential oil in ten batches of Gongju was analyzed by adopting temperature programmer.In this condition，59 common peaks were identified and GC-MS fingerprint of 59 common peaks was established preliminarily.The correlation coefficients of ten batches of Gongju were higher than 0.9.The content of Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate in volatile oil of Gongju was the highest（20%）. The method is of high degree of precision，reproducibility，and stability.The separating degree of each component in the essential oil is good.Both the established fingerprints and the component of Bicyclo[3.1.1]hept-2-en-4-ol-2，6，6-trimethyl-aceate could be used as the quality control index for Gong Chrysanthemum morifolium in Huangshan City.

Gong Chrysanthemum morifolium in Huangshan City；essential oil；GC-MS；fingerprint

TS201.2

A

1002-0306（2012）05-0067-05

2011－03－02 *通訊聯(lián)系人

高學玲（1967-），女，副教授，主要從事食品及農(nóng)產(chǎn)品加工研究。

國家星火計劃項目（2010GA710027）。