陳 潔，呂天喜，葉競雄，趙玉玲

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

金佛手總黃酮的超聲提取工藝研究

陳 潔，呂天喜，葉競雄，趙玉玲*

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004）

通過單因素以及正交實驗對金佛手總黃酮進行了超聲波提取的工藝研究，采用氫氧化鈉-亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定了金佛手總黃酮的含量。結(jié)果表明，超聲波輔助提取金佛手總黃酮的最佳工藝條件為：60%乙醇水溶液（v/v）、料液比1∶10（g/mL）、超聲溫度35℃、超聲時間15min，此條件下佛手總黃酮的含量為36.753mg/g。該方法簡單、快速、經(jīng)濟，可作為金佛手總黃酮提取的一種有效手段。

金佛手，總黃酮，超聲提取，正交實驗

佛手主要分布于熱帶和亞熱帶，我國浙江、江西、福建、廣東、廣西、四川、云南等地均有栽培[1]，其中產(chǎn)于浙江金華的佛手雅稱“金佛手”。佛手具有多種藥理作用，主要化學成分為香豆素類和黃酮類[2-4]。佛手柑是蕓香科柑橘屬植物佛手（Citrus medica var sarcodactylis）的果實，味辛、苦、酸，性溫，入肝、胃、肺經(jīng)，具有舒肝和胃、行氣止痛、祛濕化痰等功效[5]。黃酮類是指以黃酮（2-苯基-苯并-g-吡喃酮）為母體的一大類化合物，廣泛分布于植物界，主要存在于蕓香科、唇形科、豆科、傘形科、銀杏科以及菊科植物中，是許多中草藥的有效成分?，F(xiàn)代藥理研究證明，黃酮類化合物在心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和抗腫瘤方面具有明顯的藥理作用。超聲波提取植物中的黃酮類物質(zhì)是目前較新的方法[6-7]，在川佛手總黃酮提取中得到了最佳工藝[8]，但在金佛手總黃酮的提取中還未見報道。本文采用超聲波輔助提取金佛手總黃酮，對乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲溫度等四個影響因素進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成熟佛手鮮果 購自浙江金華花卉市場，外觀如觀音手，色澤金黃油亮；蘆丁標準品 中國藥品檢驗所，純度＞98%；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉 國藥集團藥業(yè)股份有限公司，分析純；實驗用水 蒸餾水，自動三重純水蒸餾器燒制。

電子分析天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司；Lambda25紫外-可見分光光度計 美國Perkin Elmer公司；KQ-5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；R1001V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DEF-300真空干燥箱 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Science-IID細胞破碎儀 上海京工實業(yè)有限公司；SZ-97A自動三重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 制樣 將新鮮佛手切成均勻薄片，放入托盤，于50～60℃鼓風干燥24h，自然冷卻后粉碎，過60目篩備用。

1.2.2 佛手總黃酮的提取工藝 精密稱取佛手粉1g共9份，按照一定料液比加入不同濃度乙醇水溶液浸泡24h。在超聲波清洗槽中提取，用真空泵抽提過濾，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收乙醇。濾液轉(zhuǎn)移入100mL容量瓶，用相同濃度的乙醇溶液稀釋至刻度。

1.2.3 蘆丁標準溶液的配制 精密稱取蘆丁標準品0.0500g，用60%乙醇水溶液溶解，在100mL容量瓶中定容，搖勻，得到濃度為0.5000mg/mL的蘆丁標準液。

1.2.4 測定波長的選擇 分別取樣液和蘆丁標準液各10mL于50mL容量瓶中，用50%乙醇水溶液稀釋至約25mL，加入1.4mL亞硝酸鈉（5%）搖勻，靜置6min；然后加入1.4mL硝酸鋁（10%），搖勻，靜置6min；最后加入10mL氫氧化鈉（1mol/L），靜置10min。以50%乙醇水溶液為空白參比，在紫外-可見分光光度計上掃描300～700nm范圍內(nèi)的圖譜（圖1）。由圖譜可知，蘆丁標準品355nm處的吸收強于510nm，而佛手樣液在355nm處有最大吸收，因此選取355nm作為測定中的最大吸收波長。

圖1 蘆丁標準品和佛手樣液的吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of rutin standard and bergamot sample liquid

1.2.5 蘆丁標準曲線及回歸方程的建立 分別取0、2、4、6、8、10mL蘆丁標準液于50mL容量瓶中，用50%乙醇水溶液稀釋至約25mL，加入1.4mL亞硝酸鈉（5%）搖勻，靜置6min；然后加入1.4mL硝酸鋁（10%），搖勻，靜置6min；最后加入10mL氫氧化鈉（1mol/L），靜置10min。以試劑做空白參比，紫外-可見分光光度計上測355nm處吸光度，記錄數(shù)據(jù)。以蘆丁標準液濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 佛手總黃酮提取的單因素實驗

1.2.6.1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響 精密稱取佛手粉1g 5份，分別加入30%、50%、60%、70%、90%的乙醇水溶液30mL，于45℃水浴超聲10min，過濾、定容，按1.2.5方法測定總黃酮含量。

1.2.6.2 料液比對黃酮含量的影響 精密稱取佛手粉1g 5份，分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25加入60%乙醇水溶液，于45℃水浴超聲10min，過濾、定容，按1.2.5方法測定總黃酮含量。

1.2.6.3 超聲時間對黃酮含量的影響 精密稱取佛手粉1g 5份，加入60%乙醇水溶液30mL，于45℃水浴分別提取10、15、20、25、30min，過濾、定容，按1.2.5方法測定總黃酮含量。

1.2.6.4 超聲溫度對黃酮含量的影響 精密稱取佛手粉1g 5份，加入60%乙醇水溶液30mL，分別于15、 25、35、45、55℃水浴中超聲提取10min，過濾、定容，按1.2.5方法測定總黃酮含量。

1.2.7 正交實驗設計 在單因素實驗基礎上，選擇乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲溫度四個因素，按照正交實驗四因素三水平設計（表1），以佛手中總黃酮的含量為指標，進行正交實驗。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.8 佛手總黃酮的測定 分別取待測提取液各10mL，按標準曲線的繪制方法測定提取液的吸光度值，根據(jù)標準曲線回歸方程計算佛手總黃酮含量。

佛手總黃酮含量（mg/g）=佛手總黃酮質(zhì)量（mg）/原料佛手總質(zhì)量（g）

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的繪制

由圖2可以看出，在0～0.10mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度之間具有良好的線性關系，線性相關性為0.9997，線性回歸方程為：y=18.539x+0.0126，其中x表示蘆丁濃度，y表示355nm處的吸光度。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Rutin standard curve

2.2 佛手總黃酮提取的單因素實驗

圖3 乙醇濃度對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on total flavonoids content

分別對影響佛手黃酮含量的單因素乙醇濃度（%）、料液比（g/mL）、超聲時間（min）和超聲溫度（℃）進行了研究。

2.2.1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響 由圖3看出，隨著乙醇濃度的提高，總黃酮含量不斷提高，其原因可能是因為隨著乙醇濃度的增加，脂溶性物質(zhì)溶出增多。乙醇濃度60%～70%時總黃酮含量達到最高，隨后開始下降，這可能是由于部分黃酮類化合物是水溶性的，若水分含量太少，黃酮類化合物不能充分溶解[9]。

2.2.2 料液比對總黃酮含量的影響 從圖4可以看出，隨著料液比的增加，總黃酮含量不斷下降，在料液比超過1∶15后，總黃酮含量的下降趨勢趨于平緩。其原因與乙醇濃度對黃酮含量的影響類似，過高的乙醇濃度對黃酮的提取并無太大益處，因為在佛手總黃酮的測定中，還有棕櫚酸等水溶性物質(zhì)的存在[3-4]。

圖4 料液比對總黃酮含量的影響Fig.4 Effectofratioofmaterialtoliquidontotalflavonoidscontent

2.2.3 超聲時間對總黃酮含量的影響 隨著超聲時間的增加，佛手中總黃酮含量逐漸提高，超過15min時，提取率反而有所降低（圖5）。其原因可能是隨著時間的增加，樣品中黏液質(zhì)等雜質(zhì)進入抽提液，使抽提液黏度增大，擴散速度變慢，導致黃酮類化合物不易溶出[7]。

圖5 超聲時間對總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on total flavonoids content

2.2.4 超聲溫度對總黃酮含量的影響 從圖6可以看出，佛手中總黃酮含量隨著超聲溫度的升高逐漸增加，但當溫度超過35℃后，黃酮含量趨于平緩。其原因可能是溫度的升高會使溶劑少量揮發(fā)，雜質(zhì)溶出量增加，從而對提取率稍有影響，且成本費用也有所增加[7]。

圖6 超聲溫度對總黃酮含量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoids content

2.3 正交實驗

L9（34）正交實驗不同條件下佛手中總黃酮的含量及極差分析見表2，方差分析見表3。

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

結(jié)果表明，四種因素對佛手中黃酮含量的影響順序依次為乙醇濃度（A）＞料液比（B）＞超聲時間（C）＞超聲溫度（D），最佳工藝條件為A2B1C2D1，即用60%乙醇水溶液（v∶v），料液比為1∶10（g/mL），于35℃超聲提取15min。在此條件下，重復提取3次，得到佛手中總黃酮平均含量為36.753mg/g。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，超聲波提取佛手中總黃酮的最佳工藝為：用60%乙醇水溶液（v∶v），料液比為1∶10（g/mL），于35℃超聲提取15min，此條件下佛手中總黃酮的含量為36.753mg/g。有關佛手總黃酮的純化以及抗氧化活性，則需要進一步研究。

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Study on the ultrasonic extraction technology of total flavonoids from citrus bergamot

CHEN Jie，LV Tian-xi，YE Jing-xiong，ZHAO Yu-ling*
（College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

The technical study on the ultrasonicwave-assited extraction of total flavonoids from citrus bergamot by experiment of single factor and orthogonal test has been studied.The total flavonoids content was obtained by sodium hydrate-sodium nitrite-aluminum nitrate assay.It showed that the best technological conditions about the ultrasonicwave-assited extraction of total flavonoids from citrus bergamot were as follows：60% ethanol water（v/v），1∶10 ratio of material to liquid（g/mL），35℃ for 15min.The content of total flavonoids from citrus bergamot was 36.753mg/g in the best technological conditions.This method was simple，quick and economical，which could be an available assay for total flavonoids from citrus bergamot.

citrus bergamot；total flavonoids；ultrasonic extraction；orthogonal test

TS255.1

B

1002-0306（2012）05-0262-04

2011－05－31 *通訊聯(lián)系人

陳潔（1989-），女，學士，研究方向：應用化學。

浙江師范大學博士科研啟動基金（ZC304009077）；浙江師范大學第五期大學生研究性學習與創(chuàng)新實驗項目（71）。