熊 偉，李雄輝，胡居吾，涂招秀，季清榮

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌330029）

薄膜-超聲法制備二氫楊梅素脂質(zhì)體的工藝研究

熊 偉，李雄輝*，胡居吾，涂招秀，季清榮

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌330029）

采用薄膜-超聲法，對二氫楊梅素脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行了研究，通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定了最佳工藝參數(shù)：卵磷脂和膽固醇比為6.2∶1（g∶g），卵磷脂和二氫楊梅素比為4.1∶1（g∶g），超聲時(shí)間為34min，緩沖液pH為7.0，在此條件下，二氫楊梅素脂質(zhì)體的包封率為88.58%。此法制備二氫楊梅素脂質(zhì)體具有操作簡便可行，脂質(zhì)體包封率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

二氫楊梅素，脂質(zhì)體，響應(yīng)面法，制備，包封率

藤茶，系葡萄科蛇葡萄屬中的一種野生藤本植物，其味甘淡、性涼，夏天泡茶多日不餿，有神茶之稱。近代醫(yī)學(xué)研究表明，藤茶及其提取物具有抑菌、降血脂、降血壓、抗氧化、降血糖、保肝護(hù)肝以及減輕乙醇中毒等功效[1-7]。藤茶的主要活性成分為黃酮類化合物，并以二氫楊梅素的含量為最高，此外還含有部分楊梅素等其它成分[8-10]。二氫楊梅素易溶于丙酮、乙醇、熱水，但脂溶性差、生物利用度低、易被氧化，這大大限制了其在醫(yī)藥和食品等行業(yè)的應(yīng)用。脂質(zhì)體作為藥物載體，是一種相對較新的微膠囊化技術(shù)，具有保護(hù)被包裹藥物、防止藥物氧化、提高藥物穩(wěn)定性、提高被包裹藥物生物利用度、使被包裹藥物具有靶向性、天然無毒、生物可降解、無免疫抑制作用等優(yōu)點(diǎn)[11-13]。目前，國內(nèi)外尚無任何關(guān)于二氫楊梅素脂質(zhì)體的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。有效成分的包封率和穩(wěn)定性是評價(jià)脂質(zhì)體的主要質(zhì)量指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜-超聲法首次嘗試將二氫楊梅素制備成脂質(zhì)體，以二氫楊梅素的包封率為考查指標(biāo)，并以響應(yīng)面分析法對影響脂質(zhì)體包封率的脂材比例、pH、超聲時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，并對二氫楊梅素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，旨在為二氫楊梅素脂質(zhì)體的制備提供參考，為二氫楊梅素系列產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤茶 江西撫州黎川，60℃干燥24h備用；二氫楊梅素對照品 中國藥品生物制品檢定所；大豆卵磷脂、膽固醇 南昌綠恒科技有限公司進(jìn)口分裝；無水乙醇、乙醚、曲拉通X-100、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 天津永大化學(xué)試劑廠，分析純；甲醇 江蘇漢邦有限責(zé)任公司，色譜純；三蒸水 自制。

Agilent1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化科技有限公司；TD-5A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JM-10002型電子天平 余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備公司；KQ200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 二氫楊梅素的制備 準(zhǔn)確稱取200g藤茶干葉后，粉碎至80目過篩，按照1∶25的料液比添加水，在95℃下提取120min后，趁熱過濾，冷卻后靜置24h，過濾，干燥得粗提物；將粗提物加丙酮回流提取2次，料液比分別為1∶5和1∶3，合并提取液后濃縮至小體積，慢慢加水沉淀，直至產(chǎn)生大量晶體，將此晶體用水按1∶50料液比進(jìn)行重結(jié)晶，重結(jié)晶5次后得到二氫楊梅素產(chǎn)品，HPLC檢測其純度為95%。

1.2.2 二氫楊梅素脂質(zhì)體的制備 精密稱取一定比例的卵磷脂、膽固醇和95%的二氫楊梅素，將二氫楊梅素溶于無水乙醇，卵磷脂、膽固醇用適量乙醚溶于圓底蒸發(fā)瓶中，兩樣混合振搖均勻，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50℃減壓蒸發(fā)至瓶壁成透明薄膜，然后加入適量磷酸鹽緩沖液將膜洗下，固定超聲功率200W，在常溫水浴中超聲一定時(shí)間，依次過0.80μm和0.45μm濾膜，即得均勻的脂質(zhì)體混懸液樣。分別考慮不同卵磷脂和膽固醇比、卵磷脂和二氫楊梅素比、超聲時(shí)間、緩沖液pH對二氫楊梅素脂質(zhì)體包封率的影響，實(shí)驗(yàn)方法如下：

在卵磷脂和二氫楊梅素比為6∶1（g∶g），超聲時(shí)間為20min，緩沖液pH為6.5時(shí)，分別取卵磷脂和膽固醇比例為1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1，考慮不同卵磷脂和膽固醇比對二氫楊梅素脂質(zhì)體包封率的影響。

在卵磷脂和膽固醇比為6∶1（g∶g），超聲時(shí)間為20min，緩沖液pH為6.5時(shí)，分別取卵磷脂和二氫楊梅素比例為2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1，考慮不同卵磷脂和二氫楊梅素比對二氫楊梅素脂質(zhì)體包封率的影響。

在卵磷脂和膽固醇比為6∶1（g∶g），卵磷脂和二氫楊梅素比為4∶1（g∶g）、超聲時(shí)間為20min，分別取緩沖液pH為6、6.5、7、7.5、8，考慮不同緩沖液pH對二氫楊梅素脂質(zhì)體包封率的影響。

在卵磷脂和膽固醇比為6∶1（g∶g），卵磷脂和二氫楊梅素比為4∶1（g∶g）、緩沖液pH為7，分別取超聲時(shí)間為10、20、30、40、50min，考慮不同超聲時(shí)間對二氫楊梅素脂質(zhì)體包封率的影響。

1.2.3 二氫楊梅素脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化 綜合前面單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取脂醇比、脂藥比、超聲時(shí)間三個(gè)對包封率影響較為顯著的因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 包封率的測定

1.2.4.1 色譜條件 采用HPLC法檢測[14-16]。操作條件：色譜柱：C183.5×150mm；流動(dòng)相：甲醇∶水∶磷酸＝27∶73∶0.1；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：290nm；進(jìn)樣量：20μL。具體操作方法為：準(zhǔn)確稱取二氫楊梅素對照品2.5mg，溶于甲醇中，并準(zhǔn)確定容至25mL作為母液，然后依次取0.2、0.4、0.6、0.8、1mL樣液至10mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，作為不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，微孔濾膜過濾后進(jìn)行測定，以色譜峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 包封率的測定方法 取400μL二氫楊梅素脂質(zhì)體樣品，用三蒸水稀釋后，3000r/min轉(zhuǎn)速下離心30min。取上清液進(jìn)樣測定游離二氫楊梅素含量，乘以稀釋倍數(shù)得游離二氫楊梅素濃度C1。另取相應(yīng)等量樣品400μL，加入10%triton X-100溶液進(jìn)行破乳，加水稀釋同樣倍數(shù)，測定二氫楊梅素含量，乘以稀釋倍數(shù)得到脂質(zhì)體中二氫楊梅素總濃度C2，則包封在脂質(zhì)體內(nèi)二氫楊梅素濃度C0=C2-C1。根據(jù)EE（%）=C0/ C2×100%，可計(jì)算出包封率（EE，%）。

1.2.5 穩(wěn)定性考察 將二氫楊梅素脂質(zhì)體分裝在玻璃瓶中，于室溫下和4℃冰箱中分別貯藏0、5、10d后，每次取3小瓶檢測其包封率，并取其平均值，以此考察脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氫楊梅素脂質(zhì)體的制備工藝

2.1.1 不同比例的卵磷脂和膽固醇對包封率的影響膽固醇能夠調(diào)節(jié)卵磷脂的凝聚結(jié)構(gòu)，改變膜的通透性，還能影響脂質(zhì)體的相變溫度，進(jìn)而引起包封率的變化。但膽固醇含量太高，組成脂質(zhì)體的磷膜量太少，會(huì)使脂質(zhì)體膜形成困難且不牢固。不同比例的卵磷脂和膽固醇對脂質(zhì)體包封率的影響見圖1。由圖1可知，隨著加入磷脂量的增多，包封率先提高后降低，當(dāng)卵磷脂和膽固醇比例為6∶1（g∶g）時(shí)，脂質(zhì)體的包封率最高。

圖1 不同比例的卵磷脂和膽固醇對包封率的影響Fig.1 Effect of different proportion of phosphatidylcholine and cholesterol on the encapsulation

2.1.2 不同比例的卵磷脂和二氫楊梅素對包封率的影響 制備二氫楊梅素脂質(zhì)體時(shí)，卵磷脂與二氫楊梅素比例不同，對包封率有明顯影響。二氫楊梅素加入量太多，超過了脂質(zhì)體能包埋的最大量，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)膜難以形成。二氫楊梅素加入量太少，則造成卵磷脂利用度不高。不同比例的卵磷脂和二氫楊梅素對包封率的影響見圖2。由圖2可知，隨著脂藥比的增大，包封率先提高后降低，當(dāng)卵磷脂和二氫楊梅素比例為4∶1（g∶g）時(shí)，包封率最高。

圖2 不同卵磷脂和二氫楊梅素比對包封率的影響Fig.2 Effect of ratio of phosphatidylcholine to dihydromyricetin on the encapsulation

2.1.3 不同pH緩沖液對包封率的影響 不同pH緩沖液對包封率的影響見圖3。由圖3可以看出，磷酸鹽緩沖液的pH從6.0變化到8.0的過程中，脂質(zhì)體包封率先提高后降低，并在7.0時(shí)包封率達(dá)到最大，但總體而言pH對脂質(zhì)體包封率的影響并不大。包封率的下降可能是因?yàn)殡S著pH的升高，使得二氫楊梅素中酚羥基的氫離子更容易電離，從而導(dǎo)致二氫楊梅素更容易以離子形態(tài)存在于脂質(zhì)體懸液中。

圖3 不同pH緩沖液對包封率的影響Fig.3 Effect of buffer solution pH on the encapsulation

2.1.4 不同超聲時(shí)間對包封率的影響 超聲會(huì)使脂質(zhì)體混懸液中粒徑大的多室脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化為較均勻的小粒徑單室脂質(zhì)體，使體系更為穩(wěn)定。由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的不斷延長，包封率先提高后降低，這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過長會(huì)引起磷脂相變，破壞脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，使包封的二氫楊梅素泄露，從而降低包封率。而時(shí)間太短，包封率雖大，但體系不夠均勻穩(wěn)定。因此，超聲30min左右時(shí)，包封效果較好。

圖4 不同超聲時(shí)間對包封率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the encapsulation

2.2 二氫楊梅素脂質(zhì)體的制備工藝的優(yōu)化

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。本方案共設(shè)15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)分析因子，3個(gè)零點(diǎn)以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)以隨機(jī)順序進(jìn)行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取其平均值。

表2 實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANONA（analysis of variance）of regression equation

各因素經(jīng)回歸擬和后，得到回歸方程為：

式中，Y為二氫楊梅素包封率（%），X1為脂醇比（g∶g），X2為脂藥比（g∶g），X3為超聲時(shí)間（min）。

當(dāng)“Pr＞F”值小于0.01即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著，從表3的分析結(jié)果可知，整體模型的“Pr＞F”小于0.01，而且方程的失擬項(xiàng)不顯著，表明該二次方程高度擬合，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。根據(jù)模型對制備工藝的最佳工藝條件進(jìn)行預(yù)測：當(dāng)脂醇比為6.19∶1，脂藥比為4.06∶1，超聲時(shí)間為33.36min，在此條件下，二氫楊梅素的包封率理論上可達(dá)88.97%?？紤]到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：脂醇比為6.2∶1，脂藥比為4.1∶1，超聲時(shí)間為34min，在此條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)取平均值，檢測二氫楊梅素的包封率為88.58%，與理論預(yù)測值基本相符。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面圖，分析脂醇比、脂藥比、超聲時(shí)間對二氫楊梅素脂質(zhì)體的影響。圖5～圖7直觀地反映了各因素對包封率的影響，比較三組圖可知，超聲時(shí)間對包封率影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；而脂醇比和脂藥比則影響不顯著，表現(xiàn)為曲線較為平滑。這與表3中各影響因素對包封率影響大小次序（超聲時(shí)間＞脂醇比＞脂藥比）一致。

圖5 脂醇比和脂藥比對包封率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Effect of ratio of phosphatidylcholine to cholesterol and phosphatidylcholine to dihydromyricetin on the encapsulation

圖6 脂醇比和超聲時(shí)間對包封率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Effect of ratio of phosphatidylcholine to cholesterol and ultrasonic time on the encapsulation

圖7 脂藥比和超聲時(shí)間對包封率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Effect of ratio of phosphatidylcholine to dihydromyricetin and ultrasonic time on the encapsulation

2.3 二氫楊梅素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

由表4可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，二氫楊梅素脂質(zhì)體的包封率并無顯著變化，顯示出良好的穩(wěn)定性。比較二氫楊梅素脂質(zhì)體在4℃和常溫條件下貯藏結(jié)果可知，二氫楊梅素脂質(zhì)體在4℃條件下表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

表4 二氫楊梅素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 4 The stability experiments of dihydromyricetin liposome

3 結(jié)論

3.1 采用薄膜－超聲法將二氫楊梅素制備成脂質(zhì)體，并借助響應(yīng)面分析法得到與實(shí)際擬和程度較高的模型及優(yōu)化工藝條件：卵磷脂和膽固醇比為6.2∶1（g∶g），卵磷脂和二氫楊梅素比為4.1∶1（g∶g），超聲時(shí)間為34min，緩沖液pH為7.0，在此條件下，二氫楊梅素脂質(zhì)體的包封率為88.58%。

3.2 薄膜－超聲法制備二氫楊梅素脂質(zhì)體具有操作簡便可行，脂質(zhì)體包封率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，因此，具有良好的應(yīng)用前景。

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Study on the dihydromyricetin liposome preparation by membrane-ultrasonic method

XIONG Wei，LI Xiong-hui*，HU Ju-wu，TU Zhao-xiu，JI Qing-rong
（Institute of Applied Chemistry，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029，China）

The membrane-ultrasonic method was used to prepare dihydromyricetin liposome.The optimum conditions were determined by the single factor and response surface tests：the phospholipid∶cholesterin was 6.2∶1，the phospholipids∶dihydromyricetin was 4.1∶1，the ultrasonic time was 34min，the buffer solution pH was 7.0.Under the optimum conditions，the encapsulation efficiency was 88.58%.Preparation of dihydromyricetin liposome by membrane-ultrasonic method was simple and feasible，it had high encapsulation efficiency and good stability.

dihydromyricetin；liposome；response surface method；preparation；encapsulation efficiency

TS201.2

B

1002-0306（2012）05-0254-04

2011－06－09 *通訊聯(lián)系人

熊偉（1982-），男，碩士研究生，助理研究員，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離與分子修飾。

江西省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（2007BN21000）。