李明珠，王玉田，張莉力，趙卉雙

（遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001）

絮凝活性菌株培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化

李明珠，王玉田*，張莉力，趙卉雙

（遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001）

選取對(duì)甘薯淀粉具有明顯絮凝效果的活性菌株，利用響應(yīng)面分析法對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以初始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間四個(gè)因素為響應(yīng)因子，絮凝率為響應(yīng)值分析各因子與絮凝率之間的影響關(guān)系。最終建立二次回歸方程為Y1=-103.602+5.166X1+5.848X2+8.312X3+0.0580X4-1.028X1X1-0.14X1X2+0.263X1X3+0.0185X1X4-0.141X2X2-0.097X2X3-0.003X2X4-0.166X3X3-0.002X3X4-0.0006X4X4，并得到相關(guān)系數(shù)R2=0.9550，對(duì)各因子的顯著性及交互作用分析后，確定了最佳培養(yǎng)條件為：初始pH6.0、接種量8%、培養(yǎng)溫度27℃、培養(yǎng)時(shí)間48h。在此培養(yǎng)條件下絮凝率的理論值為48.72%，重復(fù)驗(yàn)證值為48.65%。

絮凝活性菌株，響應(yīng)面法，培養(yǎng)條件

絮凝是使水中或液體中懸浮微粒集聚變大，或形成絮團(tuán)，從而加快粒子的聚沉，達(dá)到固—液分離的目的，這一現(xiàn)象或操作稱作絮凝，在此過程中用到的助劑稱為絮凝劑。目前使用的絮凝劑可分為金屬鹽類、有機(jī)高分子絮凝劑、無(wú)機(jī)高分子絮凝劑和微生物絮凝劑[1]。微生物絮凝劑是一類由微生物在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的，可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒凝聚、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物，其化學(xué)成分主要是糖蛋白、蛋白質(zhì)、多糖和核酸等物質(zhì)[2-3]。日本科學(xué)家在二十世紀(jì)七十年代從酞酸酯生物降解過程中發(fā)現(xiàn)了具有絮凝作用的微生物培養(yǎng)液[4]。此后，生物絮凝劑被廣泛研究，許多具有絮凝活性的菌株如霉菌、酵母菌、細(xì)菌和放線菌都已經(jīng)可以從土壤和廢水中分離篩選出來(lái)[5]，并廣泛應(yīng)用于污水處理、給水和飲用水及乳化液的油水分離[6]，而應(yīng)用于甘薯淀粉生產(chǎn)的報(bào)道卻很少。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)甘薯淀粉有很好絮凝效果的活性菌株為研究菌株，對(duì)該絮凝活性菌株培養(yǎng)過程中影響絮凝率的4個(gè)主要因素（初始pH、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到二次回歸方程的預(yù)測(cè)模型，探求最佳培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絮凝活性菌株 由本實(shí)驗(yàn)室從酸漿中分離純化所得；甘薯 購(gòu)于錦州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；蛋白胨、酵母粉、牛肉膏等 均為生化試劑；葡萄糖、乙酸鈉、硫酸錳等 均為分析純。

組織搗碎機(jī)、低速離心機(jī)、分析天平、雙人無(wú)菌操作臺(tái)、紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS—3B型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；數(shù)昱立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生化培養(yǎng)箱 上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉乳制備 選取新鮮無(wú)病害的甘薯，清理其表面雜物，清水沖洗干凈后，切成小塊，按料液比1∶3于組織搗碎機(jī)中攪拌粉碎10min，用4～6層紗布過濾除去甘薯渣混勻備用。

甘薯汁培養(yǎng)基：將甘薯清洗干凈，去皮切成小塊，按1∶5比例加水煮沸20min，用紗布過濾后取濾液4000r/min離心10min，取上清液分裝滅菌備用。

1.2.2 絮凝率的測(cè)定[7]在25mL量筒中加入25mL淀粉乳，搖勻，靜置2min。加入2mL混勻的乳酸菌培養(yǎng)液，混合、攪拌，靜置沉降3min，在液面下3mL處取樣。用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸取上清液吸光度，以未接菌的空白培養(yǎng)基代替上清液作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，絮凝率公式如下：

其中：A—空白上清液的吸光度；B—樣品上清液的吸光度。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)影響絮凝率的主要因素和微生物發(fā)酵過程中的控制條件，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需要選擇初始pH、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，按照1.2.2的方法測(cè)定絮凝率，結(jié)果取每組三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以初始pH、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度為響應(yīng)因子，絮凝率為響應(yīng)值，借助SAS8.0進(jìn)行結(jié)果分析，確定最佳培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 初始pH對(duì)絮凝率的影響 將接種量為6%的5組發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，于25℃的條件下靜止培養(yǎng)48h后測(cè)定絮凝率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 初始pH對(duì)絮凝率的影響Fig.1 Effect of pH on the flocculating activity

圖1表明，當(dāng)發(fā)酵液的初始pH在5.0～6.0之間時(shí)隨著初始pH的增大，絮凝率也會(huì)相應(yīng)增大；當(dāng)初始pH超過6.0時(shí)，隨著初始pH的增高絮凝率不再增加，甚至有下降的趨勢(shì)。由于培養(yǎng)基的初始pH直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)而影響絮凝的產(chǎn)生，所以初始pH過高或過低均對(duì)絮凝不利。

2.1.2 接種量對(duì)絮凝率的影響 取培養(yǎng)24h的種子液，分別按4%、6%、8%、10%、12%（v/v）接種至5組發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH調(diào)至7.0，于25℃的條件下靜止培養(yǎng)48h，測(cè)定絮凝率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 接種量對(duì)絮凝率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the flocculating activity

圖2表明，接種量4%時(shí)絮凝率最低，隨著接種量的增加絮凝率逐步升高，在接種量為8%～12%之間時(shí)絮凝率趨于平緩。當(dāng)接種量較少時(shí)，發(fā)酵液中的菌體數(shù)量少，絮凝率就會(huì)較低；而增大接種量會(huì)造成不必要的浪費(fèi)且會(huì)對(duì)發(fā)酵不利，影響絮凝率。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝率的影響 將接種量為6%的6組發(fā)酵培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0分別于15、20、25、30、35、40℃下培養(yǎng)48h，測(cè)定絮凝率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝率的影響Fig.3 Effect of temperature on the flocculating activity

圖3表明溫度對(duì)絮凝率的影響較大，在25～30℃范圍內(nèi)，發(fā)酵液的絮凝率最大，即活性菌株的最適生長(zhǎng)溫度范圍。當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，由于絮凝因子在高溫的情況下可能變性失活，喪失絮凝活性，所以絮凝率就會(huì)隨著溫度的升高而降低。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝率的影響 將接種量為6%的5組發(fā)酵培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0，在25℃下分別培養(yǎng)24、36、48、60、72h后測(cè)定絮凝率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝率的影響Fig.4 Effect of incubation time on the flocculating activity

圖4表明，培養(yǎng)時(shí)間在48h左右發(fā)酵液的絮凝率最大。初始一段時(shí)間發(fā)酵液的絮凝率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，繼而在一定時(shí)間段內(nèi)保持穩(wěn)定，隨后因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗及菌體產(chǎn)生的廢棄物積累抑制菌體的生長(zhǎng)，影響絮凝活性物質(zhì)的效用導(dǎo)致絮凝率的下降。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 按照SAS8.0中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)法得到的響應(yīng)面具體實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果，如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and responding value

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立全模型回歸方程：

Y=-103.602+5.166X1+5.848X2+8.312X3+0.0580X4-1.028X1X1-0.14X1X2+0.263X1X3+0.0185X1X4-0.141X2X2-0.097X2X3-0.003X2X4-0.166X3X3-0.002X3X4-0.0006X4X4；并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 3 Results of variance analysis for regression equation

圖5 初始pH與接種量的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface stereogram versus pH and inoculation amount

圖6 接種量與培養(yǎng)溫度的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface stereogram versus inoculation amount and temperature

表3的分析結(jié)果表明，初始pH與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝率的影響顯著，培養(yǎng)溫度的影響極顯著，接種量的影響不顯著；交互項(xiàng)中初始pH與接種量、接種量與培養(yǎng)溫度交互顯著，初始pH與培養(yǎng)溫度交互極顯著；二次項(xiàng)中初始pH、培養(yǎng)溫度與接種量影響極顯著。絮凝率與四個(gè)因素的回歸模型F值為18.18，“Prob＞F”值＜0.001，表明二次方程模型達(dá)到極顯著水平，可以很好地反映絮凝率與各因素之間的關(guān)系?；貧w方程的決定系數(shù)R2為0.9550，表明回歸模型和預(yù)測(cè)值之間有較好的擬合度，因此該模型可用于預(yù)測(cè)絮凝率的實(shí)際情況。

圖7 初始pH與培養(yǎng)溫度的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface stereogram versus pH and temperature

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖5～圖7。

由圖5～圖7的響應(yīng)面圖可知，響應(yīng)值存在最大值。在圖5中，絮凝率隨著初始pH的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，影響絮凝率的主要影響因子是初始pH；由圖6可知，在一定初始pH范圍內(nèi)，絮凝率隨著溫度的降低而逐漸升高，溫度在26.4～28℃范圍內(nèi)絮凝率出現(xiàn)最大值；在圖7中，絮凝率隨培養(yǎng)溫度發(fā)生的變化比較明顯，曲線陡峭。但是絮凝率隨著接種量的變化不太明顯，交互作用中培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝率的影響較接種量顯著。

2.2.2 最優(yōu)培養(yǎng)條件的預(yù)測(cè)與檢驗(yàn) 通過回歸模型的預(yù)測(cè)，得到絮凝活性菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件為初始pH5.81、接種量8.24%、培養(yǎng)溫度26.71℃、培養(yǎng)時(shí)間48.14h，預(yù)測(cè)響應(yīng)值為48.72%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法的可靠性，采用上述培養(yǎng)條件進(jìn)行6次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作性，將培養(yǎng)條件修正為初始pH6.0、接種量8%、培養(yǎng)溫度27℃、培養(yǎng)時(shí)間48h。實(shí)際測(cè)得絮凝率為48.65%，與理論值誤差約0.1%。因此，響應(yīng)面法得到的最優(yōu)培養(yǎng)條件數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際操作價(jià)值。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對(duì)絮凝活性菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的最優(yōu)培養(yǎng)條件為初始pH6.0、接種量8%、培養(yǎng)溫度27℃、培養(yǎng)時(shí)間48h。得到的回歸方程模型極顯著，對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合度較好。

[1]王艷，苗康康，胡登衛(wèi)，等.絮凝劑的研究進(jìn)展[J].化工時(shí)刊，2010，24（8）：53-58.

[2]毛艷麗，閆永勝，劉瑞群，等.微生物絮凝劑及其產(chǎn)生菌的研究新進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（10）：1616-1620.

[3]王衛(wèi)平，朱鳳香，陳曉旸，等.微生物絮凝劑的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（19）：45-48.

[4]Nakamural J，Miyashiro S，Hirose Y.Conditions for production of microbial cell flocculent by Aspergillus sojae AJ7002[J].Agric Biol Chem，1976，40（7）：1314-1347.

[5]曾常華，林波.新型微生物絮凝劑的研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與管理，2007，32（2）：54-57.

[6]高孟臣，張馨予，曲東旭.淺談微生物絮凝劑（MBF）物質(zhì)組成和應(yīng)用[J].山西建筑，2010，36（16）：147-148.

[7]Vinderola， Medici， G Perdigón.Relationship between interaction sites in the gut， hydrophobicity， mucosal immunomodulating capacities and cell wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteria C G[J].Journal of Applied Microbiology，2004，96：230-243.

Optimization of culture conditions of flocculating activity strains by response surface methodology

LI Ming-zhu，WANG Yu-tian*，ZHANG Li-li，ZHAO Hui-shuang
（Food Science and Engineering College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

Select a strain which has significant flocculation activity towards sweet potato starch，the culture conditions for this flocculation activity strain were optimized by response surface analysis.Based on singlefactor experiment，four response factors including initial pH，inoculation，cultivating temperature and cultivating time were selected as response factors and flocculation rate was used as response value，which figured out the relationship between factors and flocculation rates with Box-Behnken central composite experiment.Finally the quadratic regression equation was built：Y1=-103.602+5.166X1+5.848X2+8.312X3+0.0580X4-1.028X1X1-0.14X1X2+ 0.263X1X3+0.0185X1X4-0.141X2X2-0.097X2X3-0.003X2X4-0.166X3X3-0.002X3X4-0.0006X4X4and the correlation coefficient was R2=0.9550.By analyzing the significant impact and the interaction of each factor，the optimum culture conditions were determined as follows：initial pH of 6.0，inoculation of 8%，cultivating temperature of 27℃，cultivating time of 48h.Under this culture conditions，the theoretical value of the flocculation rate was 48.72% and the verified value was 48.65%.

flocculation activity of strain；response surface method；culture conditions

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0170-04

2011－06－13 *通訊聯(lián)系人

李明珠（1987-），男，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

肉制品深加工關(guān)鍵技術(shù)研究與新產(chǎn)品開發(fā)（2010402004）；遼寧醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金。