田建軍，張開屏，張保軍，靳 燁，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

一株高效降膽固醇嗜酸乳桿菌在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

田建軍1，張開屏2，張保軍1，靳 燁1，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

采用高效降膽固醇嗜酸乳桿菌菌株2-2和嗜熱鏈球菌調(diào)制發(fā)酵劑B，研究了發(fā)酵劑B在發(fā)酵乳中的應(yīng)用。通過與傳統(tǒng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌調(diào)制的發(fā)酵劑A的對比，結(jié)果表明，發(fā)酵劑B有較強(qiáng)的膽固醇去除效力和弱的后酸化能力。4℃條件下存放15d后發(fā)酵乳的酸度為103.6°T，發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)為2.6×107cfu/mL，高于標(biāo)準(zhǔn)的最低限制（≥106cfu/mL）。研究表明，在降膽固醇和抑制后酸化意義上，發(fā)酵劑B能夠取代發(fā)酵劑A。

嗜酸乳桿菌，降膽固醇，發(fā)酵乳，應(yīng)用

眾所周知，血清中膽固醇的含量被認(rèn)為是誘發(fā)心腦血管疾病的主要因素，統(tǒng)計(jì)表明，心腦血管疾病是目前引起人們死亡的主要?dú)⑹?，而且逐年呈上升趨勢[1-2]。同時，人體總膽固醇濃度與膳食脂質(zhì)攝入之間有著密切的關(guān)系，因此降低食品中膽固醇水平關(guān)系到人類的健康。國外大量研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌具有降低發(fā)酵食品和人體血清膽固醇的作用[3-5]。我國傳統(tǒng)食品資源豐富，尤其在內(nèi)蒙古少數(shù)民族地區(qū)，以酸奶為代表的發(fā)酵乳制品含有豐富的乳酸菌群，長期的飲食習(xí)慣證實(shí)了這些菌群的安全性和可靠性。在歐洲和日本市場上已經(jīng)有了類似的具有輔助降低血清膽固醇的乳酸菌制品以及低膽固醇含量的食品，但是國內(nèi)在這方面的研究相對較少。因此，目前研究高效降膽固醇的乳酸菌菌種用于食品加工具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)研究了一株高效降膽固醇嗜酸乳桿菌的發(fā)酵特性及其對發(fā)酵乳中膽固醇的脫出量、發(fā)酵乳制品的后酸化和4℃冷藏期間菌株的存活能力，為開發(fā)低膽固醇乳制品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高效降膽固醇嗜酸乳桿菌1株 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選獲得；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)益得乳制品實(shí)驗(yàn)廠提供；培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基[6]；膽固醇、鄰苯二甲醛 Sigma公司，均為分析純；巰基乙酸鈉、正己烷、冰醋酸 均為分析純。

MC-30L型高壓蒸汽滅菌鍋 日本ALP；SPX-150培養(yǎng)箱 中儀國科（北京）科技有限公司；U-8500分光光度計(jì) 上海天美公司；PB-20型pH計(jì) 北京多斯利儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膽固醇測定方法的建立 采用OPA法[7]（鄰苯二甲醛法）。鄰苯二甲醛溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。

1.2.1.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液的配制 參照文獻(xiàn)[8]配制。

1.2.1.2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[8]，以O(shè)D550值為橫坐標(biāo)，膽固醇濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 膽固醇濃度與OD值的關(guān)系Fig.1 The standard curve of cholesterol concentration

1.2.1.3 樣品處理及測定[7，9]待測樣品0.5g→加無水乙醇3.0mL和50%KOH 2.0mL振蕩器混合均勻，60℃水浴保溫10min→冷卻后加入正己烷5.0mL，混合均勻→加雙蒸水3.0mL后再充分混合，室溫下靜置15min使溶液分層→取正己烷層溶液2.0mL抽干→加入鄰苯二甲醛溶液2.0mL，室溫保持10min→加入1.0mL濃硫酸，混合均勻，放置10min后→測定OD550值→根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出樣品中膽固醇的含量。以發(fā)酵0h的樣品為對照樣計(jì)算其降解率。

膽固醇降解率（%）=膽固醇降解量/最初膽固醇含量×100%

1.2.2 菌株的活化 使用前將菌株在脫脂乳培養(yǎng)基中活化3代，使菌種活力達(dá)到最強(qiáng)。

1.2.3 最適生長溫度的測定[10-11，13]菌株于MRS液體培養(yǎng)液中，在不同的溫度下培養(yǎng)10h，測定菌液在620nm的濁度。

1.2.4 生長曲線的測定 滴定酸度（°T）采用吉爾涅爾度表示，pH采用pH計(jì)直接測量，生長速度采用濁度法表示，菌落計(jì)數(shù)采用稀釋平板計(jì)數(shù)法。

1.2.5 發(fā)酵劑的制備 發(fā)酵劑A所用菌種：嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌（1∶1）。發(fā)酵劑A制備方法：活化好的發(fā)酵劑A所用菌株分別按1%的添加量添加到滅菌（121℃、7min）后急冷的脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)時間以凝乳后繼續(xù)培養(yǎng)2h為準(zhǔn)，然后在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵劑B所用菌種：嗜熱鏈球菌與嗜酸乳桿菌菌株2-2（1∶1）。發(fā)酵劑B制備方法：與發(fā)酵劑A制備方法相同。

1.2.6 發(fā)酵奶的制備

1.2.6.1 發(fā)酵奶的基本配方 發(fā)酵奶1的基本配方：牛奶92%、白砂糖6%、發(fā)酵劑2%。發(fā)酵奶2的基本配方：牛奶87%、白砂糖6%、發(fā)酵劑2%、奶油5%。

1.2.6.2 發(fā)酵奶制備工藝流程 牛奶檢驗(yàn)→離心凈乳→配料→預(yù)熱均質(zhì)（65℃，20MPa）→殺菌（95℃，10min）→快速冷卻到42℃→添加發(fā)酵劑→發(fā)酵（42℃）→冷卻→成品

1.2.6.3 發(fā)酵奶制備操作要點(diǎn) 按1.2.6.1中發(fā)酵奶的基本配方分別配制發(fā)酵奶1和2各1000mL，分別預(yù)熱后（65℃）在20MPa的條件下均質(zhì)，分裝、殺菌（95℃，10min）、迅速冷卻降溫至42℃，按2%的添加量添加發(fā)酵劑，并在42℃條件下恒溫發(fā)酵，發(fā)酵到滴定酸度（吉爾涅爾度）65°T時降溫冷卻，由于發(fā)酵奶的基本配方和所加發(fā)酵劑不同，因此分別記為1-A、1-B、2-A、2-B。其中1和2代表發(fā)酵奶的基本配方，A和B代表所加的發(fā)酵劑，即A為添加發(fā)酵劑A，B為添加發(fā)酵劑B。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株2-2最適生長溫度

1%（V/V）接種菌株2-2的MRS培養(yǎng)液在不同的溫度下（20、30、35、40、45℃）培養(yǎng)10h后，于波長620nm下測定培養(yǎng)液的濁度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株2-2在不同溫度下的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain 2-2 in different temperature

從圖2可以看出，菌株2-2在不同溫度下（20、30、35、40、45℃）生長時，35℃條件下生長最為旺盛，同時在40℃生長10h的OD值大于30℃條件下生長10h的OD值，說明菌株2-2的最適生長點(diǎn)在35℃和40℃之間，這與乳酸菌通常的培養(yǎng)溫度37℃相符。

2.2 菌株2-2生長曲線

圖3 菌株2-2在MRS中的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain 2-2 in medium of MRS

按1%（v/v）接種量接種菌株2-2于MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，每隔2h測定MRS培養(yǎng)液的pH、波長620nm的吸光值和滴定酸度，用測量的數(shù)值和對應(yīng)的時間作圖，就得到菌株2-2在MRS培養(yǎng)液中的生長曲線，如圖3所示。

從圖3可以看出，在MRS液體培養(yǎng)基中，吸光值的變化范圍是0.08～2.22，pH的變化范圍是6.5～3.7，滴定酸度的變化范圍是18～131°T。菌株2-2在2h后進(jìn)入對數(shù)生長期，10h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。進(jìn)入穩(wěn)定期前，隨著時間的增加，pH不斷降低。進(jìn)入穩(wěn)定期后，pH基本保持不變，滴定酸度繼續(xù)升高，說明菌株2-2進(jìn)入穩(wěn)定期以后仍在生長，只是生長和死亡構(gòu)成動態(tài)平衡。

2.3 菌株2-2對發(fā)酵乳中膽固醇脫除量的研究

分別采用發(fā)酵劑A和發(fā)酵劑B制作酸奶，發(fā)酵到達(dá)終點(diǎn)酸度時，菌株對發(fā)酵奶中膽固醇的降解量以及脫除率如表1所示。

由表1可以看出，對于酸奶1和2來說，發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中對基質(zhì)中膽固醇都有脫除作用，在發(fā)酵奶1中發(fā)酵劑A的降解量為10.0μg/mL，降解率為5.39%，發(fā)酵劑B的降解量為26.55μg/mL，降解率為14.30%；在發(fā)酵奶2中發(fā)酵劑A的降解量為33.0μg/mL，降解率為7.83%，發(fā)酵劑B的降解量為64.7μg/mL，降解率為15.36%。由此可見，在發(fā)酵奶1和2中發(fā)酵劑B對基質(zhì)中膽固醇的脫除率大于發(fā)酵劑A對基質(zhì)中膽固醇的脫除率，其差異顯著（P＜0.05）。由此可見，開發(fā)新的菌種發(fā)酵劑對降低發(fā)酵奶自身膽固醇含量具有很大潛力。同時在高脂酸奶中，發(fā)酵劑對膽固醇的脫除率均高于普通酸奶，但均小于菌株在培養(yǎng)基MRS-CHOL中培養(yǎng)時對膽固醇的脫除率[8]，可能是由于以下原因造成：其一，在酸奶制作過程中發(fā)酵劑的發(fā)酵時間較短（一般為4～6h）；其二，酸奶中的膽固醇來源于牛奶或牛奶和奶油，牛奶和奶油中膽固醇的存在形式與MRS-CHOL培養(yǎng)基中添加的膽固醇的存在形式不同，所以菌株對膽固醇的脫除存在差別。

2.4 發(fā)酵劑在發(fā)酵乳中不同時期的產(chǎn)酸量

采用不同發(fā)酵劑發(fā)酵的牛乳，在42℃培養(yǎng)過程中定時監(jiān)測其pH及滴定酸度（吉爾涅爾度°T）的變化。在發(fā)酵過程中，在乳酸菌的作用下，分解乳糖產(chǎn)生乳酸，使牛乳的pH下降，滴定酸度上升。測定結(jié)果如表2所示，變化趨勢如圖4所示。

圖4表明，發(fā)酵劑在乳中的產(chǎn)酸量穩(wěn)定上升。在發(fā)酵初期各供試菌株由于生長緩慢，故產(chǎn)酸能力較弱，宏觀表現(xiàn)為pH的降低和滴定酸度的升高較慢。在培養(yǎng)2h后酸度和pH開始發(fā)生明顯變化，到發(fā)酵3h后，相互之間的酸度有了明顯差異，1-A發(fā)酵乳酸度為57.3而1-B發(fā)酵乳的酸度為42.7。1-A發(fā)酵到3h后出現(xiàn)凝乳現(xiàn)象，1-B發(fā)酵4.5h后出現(xiàn)凝乳現(xiàn)象，1-A發(fā)酵4h達(dá)到終點(diǎn)酸度，1-B發(fā)酵5.5h達(dá)到終點(diǎn)酸度?？梢娫谡麄€發(fā)酵過程中，發(fā)酵劑A的生長產(chǎn)酸能力強(qiáng)于發(fā)酵劑B，發(fā)酵劑B要使酸奶達(dá)到同樣的終點(diǎn)酸度較發(fā)酵劑A延遲1.5h。酸奶通常的發(fā)酵時間為4～6h，如果從發(fā)酵時間上來判斷，發(fā)酵劑B可以作為酸奶的生產(chǎn)用發(fā)酵劑。

圖4 42℃發(fā)酵乳吉爾涅爾度和pH的變化曲線Fig.4 Changes in titration acidity and pH in milk fermented at 42℃

2.5 在4℃冷藏發(fā)酵乳中菌株的存活能力

發(fā)酵乳在42℃發(fā)酵結(jié)束后，轉(zhuǎn)至4℃條件下冷藏保存，在0d和15d分別取乳樣。以稀釋平板計(jì)數(shù)法（MRS）測定在15d貯藏過程中供試菌株在冷藏發(fā)酵乳中的存活情況，如表3所示。

存活率（%）=[logN/logN0]×100%，其中：N―15d后的活菌數(shù)；N0―初始時的活菌數(shù)。

由表3中可以看出，在保存初期，發(fā)酵奶中活菌數(shù)均大于108cfu/mL，在存放兩周后活菌數(shù)仍然可以達(dá)到107cfu/mL以上，存活率分別為80.63%和83.55%。

在發(fā)酵劑B中用嗜酸乳桿菌2-2代替了傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑A中的保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌不變，而嗜酸乳桿菌是微生態(tài)制劑中常用的菌種之一，為了確保它們能夠充分發(fā)揮其健康促進(jìn)作用，保證制品中嗜酸乳桿菌較高的活菌數(shù)是非常關(guān)鍵的。有研究者指出，益生菌制品一個重要的技術(shù)特征是“該制品達(dá)到消費(fèi)者的胃腸系統(tǒng)時至少能維持106cfu/mL以上的活菌數(shù)，才能發(fā)揮潛在的益生效果?！币虼?，研究嗜酸乳桿菌的存活能力對于開發(fā)其相關(guān)制品具有重要的實(shí)踐意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4℃條件下，發(fā)酵劑所用菌株在乳中保存15d后，發(fā)酵奶能維持107cfu/mL的活菌數(shù)，它與常用酸奶發(fā)酵劑一樣表現(xiàn)出良好的存活能力。這意味著15d的貨架期內(nèi)，嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳仍能滿足其發(fā)揮益生作用的條件。

表1 膽固醇降解實(shí)驗(yàn)Table 1 Cholesterol removal rate of starter culture from yoghourt

表2 42℃發(fā)酵時的產(chǎn)酸量（n=2）Table 2 Changes in acid production of starter culture in milk feremented at 42℃（n=2）

表3 菌株在4℃冷藏發(fā)酵乳中的存活能力（n=2）Table 3 Viability of strains grown in fermented milk and stored at 4℃（n=2）

2.6 在4℃冷藏發(fā)酵乳中菌株的產(chǎn)酸能力

除了維持較高的活菌數(shù)，評價冷藏期間酸奶的另一指標(biāo)是看其是否擁有一定的細(xì)胞活力以及酸奶的后酸化程度。因此，本研究定期監(jiān)測了發(fā)酵乳在冷藏期間的產(chǎn)酸活力，來反映它們的細(xì)胞活力。結(jié)果如表4和圖5所示。

表4 發(fā)酵乳在4℃冷藏期間酸度變化（n＝3）Table 4 Changes in acid production of in fermented milk and stored at 4℃（n＝3）

圖5給出了發(fā)酵乳在冷藏期間pH和酸度變化的情況。隨著保存時間的延長，發(fā)酵乳的滴定酸度緩慢上升，1-A的滴定酸度從起始時的66.5°T上升到15d時的136.5°T，pH穩(wěn)定下降，pH從起始時的4.21下降到15d時的3.72。1-B的滴定酸度從68°T上升到103.6°T，pH從4.23下降到4.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵劑中的活體細(xì)胞仍然維持一定的酸化活力，其中1-B的后酸化現(xiàn)象明顯低于1-A，說明如果采用發(fā)酵劑B來制作酸奶，其產(chǎn)品在冷藏過程中后酸化可以得到一定的改善。

圖5 發(fā)酵乳在4℃冷藏期間滴定酸度和pH的變化Fig.5 Changes in titration acidity and pH in fermented milk and stored at 4℃

3 結(jié)論

發(fā)酵劑B對基質(zhì)中膽固醇的脫除率大于發(fā)酵劑A對基質(zhì)中膽固醇的脫除率，其差異顯著（P＜0.05）。與發(fā)酵劑A相比，發(fā)酵劑B后酸化程度低。由發(fā)酵劑B調(diào)制的發(fā)酵乳在4℃條件下存放15d后酸度為103.6°T，乳酸菌活菌數(shù)為2.6×107cfu/mL，高于標(biāo)準(zhǔn)的最低限制（≥106cfu/mL）。在降膽固醇和抑制后酸化意義上，發(fā)酵劑B能夠取代發(fā)酵劑A用于低膽固醇發(fā)酵奶的生產(chǎn)加工中。

[1]Lin SY，Ayres JW，Winkler W，et al.Lactobacillus effects on cholesterol in vitro and in vivo results[J].Journal of Dairy Science，1989，72（11）：2885-2889.

[2]Keys，Ancel.Rum cholesterol response to dietary cholesterol [J].American Journal of Clinical Nutrition，1986，44（2）：309.

[3]Liong MT，Shah NP.Effects of a Lactobacillus casei synbiotic on serum lipoprotein，intestinal microflora and organic acids in rats[J].Journal Dairy of Science，2006，89（5）：1390-1399.

[4]Jungae J，Kim S，Cho sy，et al.Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus plant arum KCT3928 by increased bile acid excretion in C57BL/6 mice[J].Nutrition，2009，26（3）：321-330.

[5]Wang Y，Xu N，Xi A，et al.Effects of Lactobacillus plantarum MA2 isolated from Tibet kefir on lipid metabolism and intestinal microflora of rats fed on high-vholesterol diet[J].Applied Microbiology Biotechnology，2009，84（2）：341-347.

[6]劉麗莉，夏延斌，唐青春，等.降膽固醇的乳酸菌篩選研究[J].食品科學(xué)，2004，25（7）：59-62.

[7]Gilland S E，Nelson C R，Maxwell C.Assimilation of cholesterol by lactobacillus acid ophilus[J].Appl Environ Microbiol，1985，49：377-3811.

[8]田建軍.高效降膽固醇乳酸菌的篩選及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2006.

[9]RudeLL，MorrisDM.Determination of cholesterol using ophthalaldehyde[J].J Lipid Res，1973，14：364-366.

[10]凌代文.乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

[11]趙傳芳，閆新華，閻喜軍.一株植物乳桿菌生長特性及生態(tài)效應(yīng)的研究[J].特產(chǎn)研究，1999（4）：44－45.

[12]Usman A.Hosono，bile tolerance，taurocholate deconjugation，and binding of cholesterol by Lactobacillus gasseri strains[J].J Dairy Sci，1999，82：243-248.

[13]Tarantomp，Sesmaf.Bile salt hydrolase plays a key role on cholesterol removal by lactobacillus reuteri[J].Biotechnol Lett，1997，19：845-847.

Application of a high cholesterol-reducing Lactobacillus acidophilus strain in fermented milk

TIAN Jian-jun1，ZHANG Kai-ping2，ZHANG Bao-jun1，JIN-Ye1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Engineering Department，Inner Mongolia Business Vocational College，Hohhot 010018，China）

The starter culture B was formulated with strain 2-2 of high cholesterol-reducing Lactobacillus acidophilus and Streptococcus thermophilus.Then the application of starter culture B in fermented milk production was studied.By comparison of starter culture B with A that formulaed traditionally with Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus，the results indicated that the starter culture B had abilities of strong cholesterol-reducing and weak post-acidification.After 15d storage at 4℃，the acidity of the fermented milk was 103.6°T and the number of living bacteria was 2.6×107cfu/mL，it was much larger than the minimum standard（≥106cfu/mL）.The study indicated that the starter culture A could be replaced by B in a sense of reducing cholesterol and inhibiting the extent of post-acidification.

Lactobacillus acidophilus；cholesterol-reducing；fermented milk；application

TS252.1

A

1002-0306（2012）05-0163-04

2011－05－18 *通訊聯(lián)系人

田建軍（1975-），男，碩士，講師，主要從事乳制品開發(fā)研究。

國家“十一五”科技支撐項(xiàng)目（2006BAD04A06）；2012內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目。