張海華，陶冠軍，周惠明，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

UPLC快速測(cè)定可溶性肽或蛋白中谷氨酰胺含量

張海華1，陶冠軍2，周惠明1，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

建立了UPLC測(cè)定谷氨酰胺的方法。采用BTI（[bis（trifluoroacetoxy）iodo]benzene，BTI）衍生化肽或蛋白中非氮端的谷氨酰胺（Glutamine，Gln），衍生產(chǎn)物L(fēng)-2，4-二氨基丁酸（L-2，4-Diaminobutyric acid，DABA）經(jīng)2，4-二硝基氟苯（2，4-Dinitrofluorobenzene，DNFB）紫外顯色后，用超高效液相色譜儀（UPLC）在355nm下進(jìn)行檢測(cè)測(cè)定。結(jié)果表明，DABA的最低檢出限為0.2ng/mL，線性范圍為1～10μg/mL。經(jīng)Ala-Gln、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和溶菌酶四種蛋白標(biāo)品檢驗(yàn)，測(cè)得標(biāo)樣中Gln的回收率為93%±2%～98%±3%。所用方法具有檢出限低、樣品用量少、高效快速等特點(diǎn)。

谷氨酰胺，超高效液相色譜，L-2，4-二氨基丁酸，2，4-二硝基氟苯

谷氨酰胺是肌體在應(yīng)激狀態(tài)下的“條件必需氨基酸”[1]，在人體內(nèi)分布廣、含量高，具有多方面作用：它是胃腸道管腔細(xì)胞的能量來源和免疫系統(tǒng)的重要燃料，參與合成谷胱甘肽，增長(zhǎng)肌肉，改善腦機(jī)能，維持腎臟、胰腺、膽囊和肝臟的正常功能等[2-5]。由于游離谷氨酰胺的不穩(wěn)定和低溶解性使得谷氨酰胺單體在應(yīng)用上受到限制。研究表明含谷氨酰胺的短肽在人體內(nèi)具有與谷氨酰胺一樣的功能[6-8]，但是結(jié)合態(tài)谷氨酰胺在常規(guī)氨基酸測(cè)定時(shí)會(huì)發(fā)生如圖1所示的反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)合態(tài)谷氨酰胺測(cè)定比較困難。關(guān)于結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的測(cè)定方法大概有三種：一是基因或序列分析法；二是酶法，采用谷氨酰胺酶將谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，以此間接測(cè)定谷氨酰胺[9]；三是BTI法，非氮端谷氨酰胺經(jīng)BTI處理后轉(zhuǎn)化為DABA，再經(jīng)HPLC檢測(cè)[10]。三種方法中序列法準(zhǔn)確可靠，但昂貴煩瑣，僅適于純蛋白或肽，對(duì)混合物無能為力；酶法簡(jiǎn)便易行、價(jià)格適中，但由于谷氨酰胺酶活力問題，很難判斷谷氨酰胺是否轉(zhuǎn)化充分，結(jié)果極可能不準(zhǔn)確；BTI法最為簡(jiǎn)便，盡管所測(cè)谷氨酰胺為蛋白或肽非氮端谷氨酰胺，但是由于氮端谷氨酰胺在溶液中存在如圖1所示的反應(yīng)，因此BTI法所測(cè)谷氨酰胺實(shí)為有效谷氨酰胺，具有較好的接受度。隨著科技的更新發(fā)展，UPLC正逐漸取代HPLC而成為液相檢測(cè)領(lǐng)域的主力軍。因此，本文采用UPLC對(duì)谷氨酰胺衍生物DABA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)采用DNFB對(duì)DABA及氨基酸進(jìn)行衍生化，旨在對(duì)BTI法進(jìn)行更新改進(jìn)，建立UPLC快速測(cè)定可溶性肽或蛋白中谷氨酰胺含量的方法，使得谷氨酰胺的檢測(cè)更高效、更準(zhǔn)確。

圖1 谷氨酰胺向焦谷氨酸、谷氨酸之間的轉(zhuǎn)化Fig.1 Conversion of glutamine into pyroglutamic acid and glutamic acid

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

L-2，4-二氨基丁酸（DABA，純度99.8%） 上海翰鴻試劑有限公司；丙胺酰谷氨酰胺（Ala-Gln，純度99.8%）、甘氨酰天冬酰胺（Gly-Asn，99.6%）、β-乳球蛋白（分子量18429u，純度99.2%）、α-乳清蛋白（分子量14000u，純度98.8%）、溶菌酶、2，4-二硝基氟苯（FDNB） 購(gòu)自Sigma公司；氨基酸混合標(biāo)樣（17種） 安捷倫科技有限公司；雙（1，1-三氟乙酸基）碘苯（BTI） 購(gòu)自Aldrich公司；其他所用試劑 均為色譜純，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；L-2，3-二氨基丙酸（DAPA，純度99.3%）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BTI衍生 100μL的0.03mg/mL DABA、DAPA或0.3mg/mL標(biāo)準(zhǔn)肽溶液，加入100μL新配制的10mg/mL BTI-乙腈溶液，并加入50μL 50μmol/mL的呲啶水溶液，混合均勻后于50℃真空室內(nèi)反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后室溫真空抽干備用。

1.2.2 酸水解 BTI衍生樣品加入200μL 6mol/L HCl于管內(nèi)，真空封管后于110℃水解24h，水解后切開封管口，真空干燥器中減壓抽干備用。

1.2.3 DNFB衍生 酸水解樣用100μL的乙腈-吡啶-三乙胺-水（10∶5∶2∶3）緩沖液溶解，真空抽干后加入100μL的同樣緩沖液，并加100μL 0.25%DNFB-乙腈溶液，密封，于50℃反應(yīng)30min。

1.2.4 UPLC分析 采用配有Masslynx V4.1軟件的Waters Acquity UPLC進(jìn)行谷氨酰胺含量的測(cè)定。儀器部件檢測(cè)參數(shù)：UPLC分析柱為Waters Acquity BEH C18（2.1×100mm，1.7μm），檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)355nm，柱溫30℃，流速0.25mL/min，儀器配有自動(dòng)進(jìn)樣器，進(jìn)樣量1μL；流動(dòng)相梯度表見表1。

表1 流動(dòng)相梯度表Table 1 Mobile phase gradient in UPLC

2 結(jié)果與分析

2.1 DABA出峰位置的確定

從圖2可以看出，DABA在8.21min時(shí)出峰，DAPA在8.08min時(shí)出峰，17種氨基酸標(biāo)樣在7.50～8.50min時(shí)間段沒有出峰。這表明在測(cè)試條件下DABA峰、DAPA峰、其它氨基酸峰能夠很好地分離，這一點(diǎn)通過小麥面筋蛋白酶解物（WGH）中谷氨酰胺的測(cè)定色譜圖可以印證。盡管DABA峰與DAPA峰僅差0.13min，但由于UPLC高分離度，因此DABA與DAPA還是能夠完全分離的，氨基酸混標(biāo)圖譜中4.26min峰和4.36min峰的分離就是很好的例子。

圖2 DABA、DAPA、氨基酸標(biāo)樣色譜圖Fig.2 ChromatographyofDABA，DAPAandaminoacidsstandard

2.2 線性檢出范圍

配制0.03～0.3μg/μL的DABA和DAPA溶液，按1.2.3和1.2.4所示進(jìn)行操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），得到回歸方程為：y（DABA，μg/mL）=288.56x+138.53（R2=0.9994）和y（DAPA，μg/mL）=273.30x+132.92（R2=0.9991）；DABA和DAPA的線性檢出限均為1～10μg/mL。

圖3 DABA和DAPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curves of DABA and DAPA

2.3 定量和最低檢出限

配制不同濃度的DABA和DAPA溶液，分別取1μL注入超高效液相色譜儀，記錄色譜圖。當(dāng)主成分峰高為噪音峰高的10倍時(shí)，DABA和DAPA的定量限為0.4ng；當(dāng)主成分峰高為噪音峰高的3倍時(shí)，DABA和DAPA的最低檢出限為0.2ng/mL。

2.4 方法回收率

在滿足線性檢出范圍的條件下配制Ala-Gln、Gly-Asn、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品的溶液，對(duì)其中谷氨酰胺和天冬酰胺的含量進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)定8次，計(jì)算測(cè)定平均值，并與理論值相比較，得到Gln和Asn的檢測(cè)回收率（見表2）分別為：93%±2%～98%±3%和77%±3%～90%±5%。與Gln相比，標(biāo)品中Asn的回收率較低，這可能是由于在BTI衍生化過程中Asn向DAPA轉(zhuǎn)化不完全造成的。這一偏低的結(jié)果也說明，通過BTI衍生化Asn的檢測(cè)方法的可行性有待商榷，新的檢測(cè)結(jié)合態(tài)Asn的方法仍需進(jìn)一步研究。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品中Gln和Asn的檢測(cè)回收率Table 2 Recovery of Gln and Asn in standard samples

3 結(jié)論

本文以BTI為衍生化試劑，將可溶性肽或蛋白的非氮端Gln轉(zhuǎn)化為DABA，而Asn轉(zhuǎn)化為DAPA。DABA和DAPA經(jīng)DNFB紫外顯色后，采用超高效液相色譜能夠快速定量DABA，從而達(dá)到了間接定量肽或蛋白中Gln的目的。在本實(shí)驗(yàn)條件下，全部氨基酸在12min內(nèi)即能夠完成分離且方法回收率良好，比專用的氨基酸檢測(cè)儀提高了近一倍的效率。另外，在本方法儀器操作過程中，所用流動(dòng)相不含難揮發(fā)鹽類（如磷酸鹽等），這對(duì)于柱子的維護(hù)和使用壽命大有好處，而且本方法在液質(zhì)聯(lián)用儀上也可以放心使用。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，采用BTI衍生法定量檢測(cè)Asn的回收率不是很高，因此對(duì)于更好地檢測(cè)Asn的方法有待于研究者們更進(jìn)一步的努力。然而對(duì)于那些對(duì)Asn定量檢測(cè)結(jié)果要求不是十分嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)來說，本方法可以快速提供一個(gè)粗略結(jié)果以供參考。

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Quick determination of glutamine in soluble protein or peptide by UPLC

ZHANG Hai-hua1，TAO Guan-jun2，ZHOU Hui-ming1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

A method of UPLC determining glutamine was developed.Glutamine in Non-nitrogen terminal of soluble protein or peptides were accordingly converted into stable L-2，4-diaminobutyric acid（DABA）in the presence of[bis（trifluoroacetoxy）iodo]benzene（BTI）.Thereafter，that DABA reacted with 2，4-Dinitrofluorobenzene（DNFB）gave rise to a final product which was detected at 355nm by UV detector accessory for UPLC.The results showed that the lowest detection limit of DABA was 0.2ng/mL，and the linear region was 1～10μg/mL. The method recovery was tested with four standards including Ala-Gln，β-lactoglobulin，α-albumin and Lysozyme，a recovery range of 93%±2%～98%±3%was obtained.In general，the method developed has advantages of quickness，lower detection limit and less sample.

glutamine；UPLC；DABA；DNFB

TS207.3

A

1002-0306（2012）01-0338-03

2010－09－29 *通訊聯(lián)系人

張海華（1982-），女，博士研究生，研究方向：方便食品及品質(zhì)改良。

國(guó)家高科技研究發(fā)展計(jì)劃863項(xiàng)目（2008AA10Z312）；江南大學(xué)博士基金項(xiàng)目（2009）。