唐曉芳，張國棟，*，王 剛

（1.西華大學生物工程學院，四川成都610039；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，四川成都611130）

Hansenula anomala轉化葡萄糖生產阿拉伯糖醇的研究

唐曉芳1，張國棟1，*，王 剛2

（1.西華大學生物工程學院，四川成都610039；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，四川成都611130）

對Hansenula anomala轉化葡萄糖生產D-阿拉伯糖醇的反應條件進行了研究。高供氧量有利于阿拉伯糖醇的生成。在一定范圍內，葡萄糖初始濃度越高，阿拉伯糖醇的產量也隨之明顯提高。并通過正交實驗，確定了最佳發(fā)酵條件為（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；發(fā)酵溫度30℃，裝液量15～20mL/500mL三角瓶，發(fā)酵時間263h。阿拉伯糖醇濃度為245.97g/L，轉化率為0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反應強度0.935g/Lh。

異常漢遜氏酵母（Hansenula anomala），D-阿拉伯糖醇，發(fā)酵

D-阿拉伯糖醇（D-Arabitol），是一種功能性食品添加劑，由于其可作為低熱量、非齲齒甜味劑而備受關注，此外，它也是許多有應用價值的藥物中間體[1]，具有很大的研究和應用價值。由于這種五碳多元醇有多種同分異構體存在，導致化學方法合成十分困難。在高滲透壓環(huán)境中（高鹽或高糖含量），耐高滲透壓酵母菌會在細胞內累積產生多元醇。這些多元醇，特別是甘油和阿拉伯糖醇，能對細胞起到協調細胞功能和滲透調節(jié)作用，所以叫做穩(wěn)定溶質（compatible solute）[2-5]。轉化葡萄糖形成阿拉伯糖醇，是由于酵母細胞在高的葡萄糖濃度下，會增強磷酸戊糖途徑，產生充足的有利于細胞生長和合成的NADPH。通過NADP+再生，從而形成阿拉伯糖醇。也就是說，阿拉伯糖醇經由D-ribulose-5-phosphate脫磷酸，然后在D-阿拉伯糖醇脫氫酶催化下形成。反應需要NADPH參與完成。能夠轉化葡萄糖形成阿拉伯糖醇的酵母菌有Saccharomyces、Debaryomyces、Hansenula、Pichia和Candida[3，6]。目前對阿拉伯糖醇的研究報道還很少。蔡莉等從含糖量高的自然界樣品中分離產阿拉伯糖醇的菌株，獲得1株產量較高的耐高滲酵母[7]。張麗麗等利用漢遜德巴利酵母發(fā)酵葡萄糖生產D-阿拉伯糖醇，研究了影響其發(fā)酵的因素和最佳發(fā)酵條件[8]。本實驗研究了Hansenula anomala轉化葡萄糖生產D-阿拉伯糖醇的影響因素，并摸索有利于阿拉伯糖醇形成的條件，為大規(guī)模生產D-阿拉伯糖醇提供有益的指導和幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Hansenula anomala strain GA24 中國科學院微生物所保存；斜面與平板培養(yǎng)基 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖300g，酵母膏5g，蛋白胨5g，pH 5.0；發(fā)酵培養(yǎng)基 除了實驗中另行說明外，均與種子培養(yǎng)基相同，上述培養(yǎng)基均采用112.6℃滅菌30min。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)與發(fā)酵條件 種子培養(yǎng)：500mL三角瓶裝入50mL培養(yǎng)液，接入試管斜面菌體1環(huán)，30℃、220r/min搖床培養(yǎng)48h。發(fā)酵培養(yǎng)：500mL三角瓶，裝液量根據實驗而定。接入種子液，接種量5%。30℃、220r/min搖床培養(yǎng)，隔時取樣分析。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 細胞量測定 分光光度計測量OD650來表示細胞濃度。

1.2.2.2 葡萄糖含量測定 采用SBA-40型谷氨酸（乳酸）-葡萄糖雙功能分析儀。

1.2.2.3 阿拉伯糖醇和甘油濃度采用HPLC測定 樣品經過12000r/min離心5min，除去菌體和雜質。HPLC檢測條件為：色譜柱HPX-87H，柱溫45℃，流動相8mmol/L H2SO4，流速0.5mL/min，檢測器RI@8x，進樣量10μL。

2 結果與分析

2.1 阿拉伯糖醇發(fā)酵時間曲線和規(guī)律

圖1為阿拉伯糖醇發(fā)酵隨時間變化曲線。從圖中可看出，隨著時間的進行，葡萄糖濃度逐步降低，而阿拉伯糖醇、甘油的含量以及細胞量則逐步升高，在葡萄糖消耗完畢時，阿拉伯糖醇、甘油的含量以及細胞量都達到最大。

圖1 阿拉伯糖醇濃度隨發(fā)酵時間關系曲線Fig.1 Relationship of D-Arabitol concentration and fermentation time

為了進一步探明阿拉伯糖醇生成的規(guī)律，特別是發(fā)酵后期，葡萄糖消耗完畢后阿拉伯糖醇的濃度變化，采用如下發(fā)酵條件進行了實驗（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0，裝液量20mL/500mL三角瓶。實驗結果見圖2、圖3。

在圖2中可看到，從發(fā)酵時間達到119h開始，此時葡萄糖已經消耗完畢，而阿拉伯糖醇的濃度卻開始迅速增大，直到263h達到最大值245.97g/L，轉化率為0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反應強度0.935g/L·h。

由于葡萄糖已經消耗為零，而其他營養(yǎng)物質如酵母膏、蛋白胨以及無機鹽，經過長時間的發(fā)酵，也幾乎沒有殘留。所以，在發(fā)酵后期這種阿拉伯糖醇迅速增加的現象，不可能是酵母細胞利用營養(yǎng)成分轉化的結果。唯一可行的解釋是，Hansenula anomala在高滲透壓環(huán)境中（高的葡萄糖含量），積累形成的大量胞內物質/阿拉伯糖醇和甘油，能對細胞起到穩(wěn)定和調節(jié)作用。而一旦外界環(huán)境中高滲物質葡萄糖消耗殆盡，阿拉伯糖醇和甘油作為穩(wěn)定溶質就失去在細胞中存在的基礎和意義，并從細胞內向細胞外轉移滲透，從而出現發(fā)酵后期這些物質在培養(yǎng)液中濃度繼續(xù)增加的現象。

所以，在培養(yǎng)液中葡萄糖耗盡后，繼續(xù)對細胞發(fā)酵培養(yǎng)是必要的，這有利于細胞內阿拉伯糖醇的滲出，提高阿拉伯糖醇的產量和得率。

圖2 葡萄糖消耗完畢后阿拉伯糖醇濃度隨發(fā)酵時間變化曲線Fig.2 Relationship of D-Arabitol concentration and fermentation time after the glucose consumed

圖3 葡萄糖消耗完畢后阿拉伯糖醇轉化率和平均反應強度隨發(fā)酵時間變化規(guī)律Fig.3 Relationship of D-Arabitol production and fermentation time after the glucose consumed

2.2 裝液量對阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響

氧的供應對阿拉伯糖醇的產生非常重要。資料報道認為，高的氧供應可以增強磷酸戊糖途徑，累積NADPH[6，9]。通過NADP+再生，形成阿拉伯糖醇。實驗采用改變裝液量來摸索氧對阿拉伯糖醇產生的影響。

圖4 裝液量對阿拉伯糖醇、甘油產量以及細胞量的影響Fig.4 Effect of aeration rate upon D-Arabitol,glycerol and biomass yield

實驗可得出，裝液量越少越有利于阿拉伯糖醇的轉化。同時，裝液量越少，細胞量也越大。在裝液量為15、20mL時，沒有產生甘油。在所有實驗中，我們發(fā)現甘油作為副產物，含量較少，但是遺憾的是，在實驗條件下，它似乎沒有表現出產生的規(guī)律。

高的氧供應有利于阿拉伯糖醇的形成，是由于增強了磷酸戊糖途徑的結果。此外，我們發(fā)現，所有的實驗都顯示了這樣一個規(guī)律：細胞量大，阿拉伯糖醇的產量就高。而良好的供氧，正好有利于細胞的生長。所以，在另一方面，高的氧供應可以促進阿拉伯糖醇的產生，也正是因為其可以促進細胞生長的結果。

2.3 初始葡萄糖濃度對阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響

圖5 葡萄糖初始濃度對阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of initial glucose concentration on D-Arabitol yield

圖6 葡萄糖初始濃度對阿拉伯糖醇轉化率和平均反應強度的影響Fig.6 Effect of initial glucose concentration on D-Arabitol production

圖5的實驗結果可知，葡萄糖初始濃度越高，阿拉伯糖醇的產量也隨之明顯提高。細胞量在初始濃度為400g/L時達到最大，葡萄糖濃度升高到500g/L，則略有下降，說明葡萄糖初始濃度過高會對細胞生長有所抑制。在圖6中，隨著葡萄糖濃度的提高，平均反應強度也逐步增大。當葡萄糖濃度為400g/L時，轉化率最高。最終確定500g/L的葡萄糖初始濃度作為最佳發(fā)酵條件，雖然其轉化率不是最大，但是它的阿拉伯糖醇產量和平均反應強度均是最好。

2.4 氮源和無機鹽對阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響

為進一步研究氮源和無機鹽對阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響，獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，正交實驗L8（27）被設計進行。轉化率（g阿拉伯糖醇/100g葡萄糖）作為實驗結果進行正交數據分析，同樣，把阿拉伯糖醇產量或者平均反應強度作為數據分析將得到完全相同的結果。

表1 阿拉伯糖醇發(fā)酵條件正交實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of L8（27）orthogonal test on DArabitol fermentation

從正交實驗結果分析來看，各因素的極差，與空白項相比，都較小，說明各單一因素對阿拉伯糖醇發(fā)酵的影響不顯著。最佳因素水平為A2B1C1D1E1F1。但是，從表3則發(fā)現，酵母膏在水平1時結果更好，而且此時酵母膏用量低，節(jié)約成本。所以，確定最佳發(fā)酵條件為A1B1C1D1E1F1，即（g/L）：葡萄糖500，酵母膏2，蛋白胨2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；發(fā)酵溫度30℃，裝液量15～20mL/500mL三角瓶，發(fā)酵時間263h，阿拉伯糖醇濃度245.97g/L，轉化率為0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反應強度0.935g/L·h。

3 結論

表2 L8（27）正交實驗結果數據處理Table 2 Result of L8（27）orthogonal test

表3 酵母膏與其他各因素的交互作用Table 3 Interaction of yeast extract and other factors

阿拉伯糖醇作為多元糖醇的一種，在機體內的代謝與胰島素無關，同時又不是口腔微生物的適宜作用底物，所以食用不致牙齒齲變，而且大部分多元醇能量較低，因此是一類重要的功能性食品添加劑和基料。D-阿拉伯糖醇的應用較廣泛。在食品領域，除用作新型高檔食品甜味劑外，還可改善酒精飲料的品質、并可用做調制糖漿的基質等。在醫(yī)藥領域，是合成一些神經藥物的中間體。

本文應用耐高滲酵母Hansenula anomala，轉化葡萄糖生產D-阿拉伯糖醇，研究了發(fā)酵的主要影響因素和發(fā)酵條件。結果表明，培養(yǎng)基中葡萄糖含量以及發(fā)酵過程中的溶氧對其發(fā)酵影響較大。提高發(fā)酵中的供氧，有利于阿拉伯糖醇的生成；同時，葡萄糖初始濃度越高，阿拉伯糖醇的產量也明顯提高。我們也對D-阿拉伯糖醇發(fā)酵的培養(yǎng)基配方進行了研究，確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件：在最佳培養(yǎng)基條件下，裝液量15～20mL/500mL三角瓶，30℃發(fā)酵時間263h，得到產物阿拉伯糖醇濃度為245.97g/L，轉化率為0.49g阿拉伯糖醇/g葡萄糖，平均反應強度0.935g/Lh。

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Study on production of arabitol from glucose by Hansenula anomala

TANG Xiao-fang1，ZHANG Guo-dong1，*，WANG Gang2
（1.Department of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China；2.Sichuan Provincial Food Fermentation Industry Research and Design Institute，Chengdu 611130，China）

Production of D-arabitol from glucose by Hansenula anomala strain GA24 was studied.Some of the influencing factors were determined：aeration，osmotic pressure and medium.The best fermentation conditions were （g/L）：glucose 500，yeast extract 2，peptone 2，CaCl20.5，（NH4）2SO45，MgSO41，KH2PO43，pH5.0；the temperature at 30℃，15～20mL medium contained in 500mL Erlenmeyer flask，and 263h of cultivation.

Hansenula anomala；D-Arabitol；fermentation

TS201.2

A

1002-0306（2012）01-0314-04

2010－12－22 *通訊聯系人

唐曉芳（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。