顏廷才，張 旋，孟憲軍，張 琦

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

β-葡萄糖苷酶酶解刺嫩芽皂甙最佳工藝條件的研究

顏廷才，張 旋*，孟憲軍，張 琦

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

以遼寧本溪產(chǎn)刺嫩芽提取的總皂甙為實(shí)驗(yàn)原料，探討了β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽總皂甙的工藝條件與技術(shù)參數(shù)。采用苯酚-硫酸比色法測定葡萄糖含量，確定酶解效果。結(jié)果表明：葡萄糖濃度范圍在0～0.1mg/mL內(nèi)，其吸光值與葡萄糖濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：考慮到β-葡萄糖苷酶水解成本與效率，50mg的刺嫩芽皂甙分別在β-葡萄糖苷酶用量為2.0mg，酶解溫度為40℃，酶解處理時(shí)間為120min時(shí)的酶解效果最好。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽皂甙的影響程度依次為酶解溫度gt;酶用量gt;酶解時(shí)間，三因素的最佳水平組合為：在pH為6.5的緩沖液體系中，酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間為120min，用量為3.0mg。

刺嫩芽，β-葡萄糖苷酶，皂甙，刺嫩芽皂甙，酶解

刺嫩芽[Aralia elata（Miq）Seem]為五加科楤木屬植物，又名龍牙楤木、刺老鴉、樹頭菜等。刺嫩芽營養(yǎng)豐富、口感佳，屬山野菜中之珍品，素有“天下第一山珍”之美稱[1]。刺嫩芽不僅是一種名貴山野菜，還含有豐富的皂甙類成分，具有較高的藥用價(jià)值。刺嫩芽皂甙和人參皂甙相似，有消炎、利尿、強(qiáng)心、免疫和防癌等作用[2-4]，近年來皂甙成為有機(jī)化學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[5]。刺嫩芽皂甙含量雖然比人參高，但是毒性也比人參皂甙大，這限制了刺嫩芽皂甙的應(yīng)用[6]。目前，對皂甙活性改造方面研究比較多的是人參皂甙，方法主要有酸催化水解法、乙酞解法、降解水解法、光解法、堿裂解法和酶水解法等[7-9]。酶水解法為一種選擇性水解反應(yīng)，達(dá)到定向水解的目的。高峰淀粉酶（Takacdiastase）、橙皮甙酶[10]、人體腸內(nèi)細(xì)菌[11]、β-葡萄糖苷酶等水解人參皂甙得到高抗癌活性的皂甙單體[12]。由于原料和提取量的限制，對于刺嫩芽皂甙的活性研究局限于活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，Yoshikawa、Saito S等研究結(jié)果證明，以齊墩果酸或常春藤皂甙元為皂甙元的皂甙，在皂甙元的3位和28位上均有單糖鏈，活性較高[16]。但是，目前關(guān)于改進(jìn)刺嫩芽皂甙結(jié)構(gòu)來提高活性的方法研究方面，經(jīng)過文獻(xiàn)檢索沒有檢索到相關(guān)的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過研究β-葡萄糖苷酶水解處理刺嫩芽皂甙，降解掉部分糖基團(tuán)，降低刺嫩芽皂甙毒性，提高其活性，擴(kuò)大刺嫩芽皂甙的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺嫩芽皂甙粗品 由本實(shí)驗(yàn)室自制；乙醇、氯仿、冰乙酸、苯酚、硫酸、正丁醇等試劑 均為分析純，沈陽化學(xué)試劑廠；D（+）葡萄糖 上?；瘜W(xué)醫(yī)藥公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所，批號：110709-200304，供含量測定用；β-葡萄糖苷酶 Sigma公司。

TDL-5000B型離心機(jī) 上海安亭儀器廠；微量進(jìn)樣器（25μL） 上海安亭微量進(jìn)樣器廠；UNICUV-4802H紫外可見分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海博通儀器廠；SH2-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；PHS-25型酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；DEF真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FA2004電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表1 三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.1 苯酚-硫酸法測定糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取105℃烘干至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖25.0mg置于250mL容量瓶中，加水至刻度并搖勻，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加水補(bǔ)至1.0mL，然后加入5%苯酚1.6mL及濃硫酸7.0mL，充分搖勻，室溫放置25min以后于490nm測定吸光度，以蒸餾水為空白按同樣顯色操作，以糖濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程。

1.2.2 糖含量計(jì)算 稱取50mg刺嫩芽皂甙，加入50mL pH為6.5的緩沖液和2mL 1mg/mL的β-葡萄糖苷酶，在40℃條件下水解90min，反應(yīng)結(jié)束后，水解液用100mL正丁醇萃取，取下層水相，脫蛋白處理后測定體積，取1mL加入5%苯酚1.6mL及濃硫酸7.0mL，充分搖勻，室溫放置25min后于490nm測吸光度，換算出糖的含量。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) β-葡萄糖苷酶用量對酶解效果的影響：稱取50mg刺嫩芽皂甙，加入50mL pH為6.5的緩沖液和1、2、3、4、5mL 1mg/mL的β-葡萄糖苷酶，在40℃條件下水解90min，反應(yīng)結(jié)束后，水解液用100mL正丁醇萃取，取下層水相，脫蛋白處理后測定體積，取1mL加入5%苯酚1.6mL及濃硫酸7.0mL，充分搖勻，室溫放置25min后于490nm測定吸光度，換算出糖的含量。

酶解溫度對酶解效果的影響：溫度設(shè)置為20、30、40、50、60℃，水解90min，其他處理操作相同上。

酶解時(shí)間對酶解效果的影響：在40℃條件下，酶解時(shí)間為60、90、120、150、180min，其他處理操作同上。

1.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 通過上述單因素實(shí)驗(yàn)確定三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平，因素水平設(shè)計(jì)見表1，進(jìn)一步確定主要影響β-葡萄糖苷酶酶解效果的因素和參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值曲線的方程為：Y=6.8557X，相關(guān)系數(shù)R2值達(dá)到0.9978?？梢?，葡萄糖濃度范圍在0～0.1mg/mL內(nèi)，其吸光值與葡萄糖濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可以采用苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量，根據(jù)葡萄糖的吸光值換算出葡萄糖的濃度。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard absorbency curve of glucose

2.2 酶用量對刺嫩芽皂甙酶解效果的影響

實(shí)驗(yàn)分別選擇酶用量為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg，在水解溫度為38℃，水解時(shí)間120min的條件下水解刺嫩芽皂甙，結(jié)果如圖2所示。由圖中變化趨勢可以看出，隨著β-葡萄糖苷酶使用量的增加，刺嫩芽皂甙的水解率逐漸升高，溶液中的單糖的濃度逐漸增加，但當(dāng)加酶量超過2.0mg時(shí)，刺嫩芽皂甙的水解率增加幅度很小，這說明2.0mg β-葡萄糖苷酶經(jīng)過2h的作用后，已經(jīng)基本上把刺嫩芽皂甙里的葡萄糖全水解下來，因此，從成本方面考慮，本實(shí)驗(yàn)確定50mg的刺嫩芽皂甙酶用量為2.0mg。

圖2 酶用量對刺嫩芽皂甙水解的影響Fig.2 Effect of β-glucosidase quantity on saponin hydrolyzation

2.3 酶解溫度對刺嫩芽皂甙酶解效果的影響

分別選擇酶解溫度為20、30、40、50、60℃，水解時(shí)間120min，加酶量2.0mg的條件下用β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽皂甙，考察溫度對水解的影響。由圖3的結(jié)果可以看出，酶解溫度對刺嫩芽皂甙糖苷鍵的水解程度影響很大，初期隨著酶解溫度的增加刺嫩芽皂甙溶液中的單糖含量逐漸升高，當(dāng)酶解溫度為40℃時(shí)，溶液中的單糖濃度趨近最大值0.059mg/mL，溫度再升高，溶液中的單糖濃度反而迅速下降，這說明β-葡萄糖苷酶也屬于不耐熱的酶，超過其最佳作用溫度以后，溫度再升高會(huì)使酶部分失去活性，降低了水解能力，導(dǎo)致溶液中的單糖濃度降低。因此，β-葡萄糖苷酶最佳酶解溫度為40℃。

圖3 酶解溫度對刺嫩芽皂甙水解的影響Fig.3 Effect of hydrolyzing temperature on saponins hydrolyzation

2.4 酶解時(shí)間對刺嫩芽皂甙酶解效果的影響

分別選擇水解時(shí)間60、90、120、150、180min，在水解溫度38℃，β-葡萄糖苷酶酶用量2.0mg的條件下對刺嫩芽皂甙進(jìn)行水解，結(jié)果如圖4所示。由圖4中結(jié)果可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，刺嫩芽皂甙的水解程度逐漸加強(qiáng)，單糖的含量也逐漸增加；但當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到120min時(shí)，刺嫩芽皂甙的水解液中的單糖含量增加趨勢變得極其微弱，這說明120min的時(shí)間β-葡萄糖苷酶作用基本完成，把大部分的β-葡萄糖苷鍵水解完成，時(shí)間再延長已經(jīng)沒有底物可以利用了，考慮到酶解的效率，因此酶解處理的最佳時(shí)間為120min。

圖4 酶解時(shí)間對刺嫩芽皂甙水解程度的影響Fig.4 Effect of hydrolyzing time on saponins hydrolyzation

2.5 β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽皂甙的正交實(shí)驗(yàn)

表2 β-葡萄糖酶水解法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表Table 2 The results of orthogonal test of β-glucosidase hydrolyzing saponins

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們選擇了酶用量為1.0、2.0、3.0mg，酶解溫度35、40、45℃，酶處理時(shí)間100、120、140min，三個(gè)因素三水平對β-葡萄糖苷酶酶法水解條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。從表2中的極差分析結(jié)果可知，三因素對刺嫩芽皂甙水解的影響程度依次為酶解溫度gt;酶用量gt;酶解時(shí)間，三因素的最佳水平組合為A2B2C3即在pH為6.5的緩沖液體系中，酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間為120min，β-葡萄糖苷酶用量為3.0mg，酶解后葡萄糖含量為0.070mg/mL。由表中的方差分析結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶酶解溫度是影響水解程度的最重要的一個(gè)因素，酶解的溫度不宜太高，溫度高會(huì)導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶失活或酶活力降低。由β-葡萄糖苷酶水解的工藝條件可以看出，此法的水解條件溫和，具有水解率高，水解專一性好，水解程度可以控制等優(yōu)點(diǎn)，適合于皂甙定向水解掉葡萄糖。β-葡萄糖苷酶酶解總皂甙后，高活性皂甙元以及總皂甙的活性是否提高還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。

3 結(jié)論

苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量時(shí)，葡萄糖濃度范圍在0.0～0.1mg/mL內(nèi)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值曲線的方程為：Y=6.8557X，R2值達(dá)到0.9978，其吸光值與葡萄糖濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：考慮到β-葡萄糖苷酶水解的成本與效率，50mg的刺嫩芽皂甙分別在β-葡萄糖苷酶用量為2.0mg，酶解溫度為40℃，酶解處理的時(shí)間為120min時(shí)，酶解效果最好。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對β-葡萄糖苷酶水解刺嫩芽皂甙的影響程度依次為酶解溫度gt;酶用量gt;酶解時(shí)間，三因素的最佳水平組合為A2B2C3，即在pH為6.5的緩沖液體系中，酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間為120min，用量為3.0mg，這些條件下酶解后的溶液中葡萄糖含量為0.070mg/mL。

[1]馬志強(qiáng).刺龍芽化學(xué)組成及生物活性的研究[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)博士學(xué)位論文，2004.

[2]吳立東，趙鳳珍.刺嫩芽資源的經(jīng)營利用[J].林業(yè)勘查設(shè)計(jì)，2004，130（2）：53.

[3]石雪萍，姚惠源.植物皂甙測定方法的進(jìn)展[J].理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊，2007（6）：86-89.

[4]顏廷才，劉靜，孟憲軍.HPLC法測定刺嫩芽皂甙中齊墩果酸的含量[J].食品研究與開發(fā)，2008（2）：114-116.

[5]方幼蘭.玫瑰茄總皂甙的單體分離與結(jié)構(gòu)分析[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，43（5）：657.

[6]顏廷才，孟憲軍，劉靜.超聲波提取刺嫩芽中齊墩果酸類皂甙的工藝研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008（5）：170-173.

[7]Janaína Koelzer，Diana Ana Pereira，Juliana Bastos Dalmarco. Evaluation of the anti-inflammatory efficiency of Lotus corniculatus [J].Food Chemistry，2009，117：444-450.

[8]王文平.木瓜中齊墩果酸的分離提取及含量測定[J].食品科學(xué)，2004，25（9）：151-155.

[9]田燕.齊墩果酸微膠囊的制備與溶出度的測定[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（1）：91-92.

[10]Cho Joonghyung，Lee Jiyun，Sim Sangsoo，et al.Inhibitory effects of diterpene acids from root of Aralia cordata on IgE-mediated asthma in guinea pigs[J].Pulmonary Pharmacologyamp; Therapeutics，2010（2）：1-10.

[11]奚樹剛.龍芽蔥木總皂苷對大鼠早期糖尿病心肌病及糖尿病腎病保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].長春：吉林大學(xué)博士學(xué)位論文，2007.

[12]Min Songa.Determination of oleanolic acid in human plasma and study of its pharmacokinetics in Chinese healthy male volunteers by HPLC tandem mass spectrometry[J].Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006（4）：190-196.

[13]Suh Seokjong，Jin Unho，Kim Kyungwoon，et al.Triterpenoid saponin，oleanolic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl（1-3）-a-L-rhamnopyranosyl（1-2）-a-L-arabinopyranoside（OA）from Aralia elata inhibits LPS-induced nitric oxide production by downregulated NF-kB in raw 264.7 cells[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，2007，46：227-233.

[14]Li Shigang，Wang Degui，Tian Wei.Characterization and antitumor activity of a polysaccharide from Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz[J].Carbonhydrate Polymers，2008，73：344-350.

[15]Nils Germonprez，Luc Vanpuyvelde，Louis Maes.New pentacyclic triterpene saponins with strong anti-leishmanial activity from the leaves of maesa balansae[J].Tetrahedron，2004，60：219-228.

[16]Lee Mihyun，Jeong Jaehun，Seo Jinwook.Enhanced Triterpene and Phytosterol Biosynthesis in Panax ginseng Overexpressing squalene synthase gene[J].Plantamp;Cell Physiology，2004（8）：976-984.

Optimizing the technologic conditions of aralosides hydrolyzed with β-glucosidase

YAN Ting-cai，ZHANG Xuan*，MENG Xian-jun，ZHANG Qi
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

The material was saponin extracted from Aralia elata（Miq）Seem saponins which planted in Benxi City Liaoning province.The technologic conditions and parameters of aralosides hydrolyzed by β-glucosidase were studied.Effects of hydrolyzation were testified by determining glucose’s concentration with colorimetry of phenol-sulfate acid.The results indicated：the absorbency presents good linearity with glucose’s concentration within 0.1mg/mL.The results of single factor test indicated：considering the cost and efficiency of glucosidase the effects of hydrolyzation were best at the condition of β-glucosidase dosage 2.0mg，hydrolyzing temperature 40℃ and hydrolyzing time 120min separately.The results of orthogonal test indicated：the order of the factors affecting notably hydrolyzation is hydrolyzing temperature，hydrolyzing time and β-glucosidase dosage.The best levels of the factors were hydrolyzing temperature 40℃，hydrolyzing time 120min and β-glucosidase dosage 3.0mg.

Aralia elata（Miq）Seem；β-glucosidase；saponin；elatoside；hydrolyzation

TS201.1

B

1002-0306（2012）01-0282-04

2010-09-13 *通訊聯(lián)系人

顏廷才（1977-），男，博士，講師，研究方向：果蔬深加工與活性物質(zhì)提取。

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)青年基金項(xiàng)目（2005039）。