溫斯穎，韓衍青，方東路，陳 威，吳菊清，徐幸蓮，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

超高壓協(xié)同乳酸鏈球菌素抑制低溫火腿中的耐壓腐敗菌

溫斯穎1，韓衍青2，方東路1，陳 威1，吳菊清2，徐幸蓮2，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

為探尋低溫肉制品中耐壓腐敗菌的抑制手段，揭示超高壓和乳酸鏈球菌素之間的協(xié)同抑菌效應(yīng)。以肉制品中典型的耐壓腐敗菌綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌為供試材料，評(píng)價(jià)二者在1～500μg/mL的乳酸鏈球菌素存在條件下的生長(zhǎng)情況，并結(jié)合100～600MPa（5min，20℃）的超高壓處理研究不同壓力條件與乳酸鏈球菌素之間的協(xié)同增效作用。結(jié)果表明：隨著乳酸鏈球菌素添加量的增加，兩種菌的數(shù)量急劇降低，當(dāng)添加量達(dá)到200μg/mL時(shí)，對(duì)二者的抑制程度達(dá)到最大；單獨(dú)超高壓處理時(shí)，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌分別在400MPa和300MPa的壓力下受到顯著抑制。而超高壓結(jié)合200μg/mL乳酸鏈球菌素處理時(shí)，二者受到顯著抑制的壓力均降低到100MPa；500MPa，5min，20℃的超高壓條件結(jié)合200μg/mL乳酸鏈球菌素處理能夠抑制綠色魏斯菌數(shù)達(dá)9lg（cfu/mL）。超高壓和乳酸鏈球菌素之間存在顯著的協(xié)同作用，乳酸鏈球菌素的添加將會(huì)有效降低工業(yè)化生產(chǎn)中超高壓的壓力水平。

超高壓，乳酸鏈球菌素，耐壓菌

超高壓處理（high pressure processing，HPP）能夠很好地保持食品原有的色香味型[1]，是目前一項(xiàng)公認(rèn)的具有發(fā)展前景的非熱加工技術(shù)。如今超高壓處理食品在日本、韓國(guó)、歐美國(guó)家均已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，而我國(guó)剛剛進(jìn)入起步階段，各種罐頭制品、果蔬制品以及水產(chǎn)制品均開始了初步嘗試，技術(shù)手段亟待成熟，尤其表現(xiàn)在壓力大小的選擇方面。600MPa，12℃，10min的超高壓處理能夠有效改善低溫火腿的貨架期[2]。然而600MPa以及更高的壓力對(duì)超高壓設(shè)備性能要求比較高，高壓力一方面增加了加工成本，另一方面存在潛在的引起肉品品質(zhì)指標(biāo)惡化的風(fēng)險(xiǎn)，比如褪色、軟化以及脂肪氧化等。食品加工過(guò)程中一般采用能夠達(dá)到殺菌滅酶效果的最小壓力。因此，有效降低壓力水平對(duì)于推進(jìn)超高壓食品工業(yè)化生產(chǎn)有重要作用[3]。乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種由乳酸乳球菌乳酸亞種合成的細(xì)菌素，是目前公認(rèn)的安全高效天然食品防腐劑。徐勝等[4]發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素添加濃度在100～200μg/mL范圍內(nèi)，經(jīng)超高壓處理的火腿腸持水性、色澤無(wú)顯著變化，貨架期有效改善。Elaine等[5]在牛奶抑菌實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，超高壓和乳酸鏈球菌素結(jié)合能夠顯著提高抑菌效果。Dalgaard研究認(rèn)為，大多數(shù)情況下，食品中只有特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）參與腐敗過(guò)程[6-7]。在貯藏過(guò)程中，SSO的快速生長(zhǎng)繁殖主導(dǎo)了食品的腐敗過(guò)程[8]。綠色魏斯菌（Weissella viridescens）和腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是目前證實(shí)的超高壓低溫肉制品中的兩株典型腐敗菌[9-11]，是超高壓處理肉制品中主要分離到的特定腐敗微生物，也是目前低溫肉制品保鮮領(lǐng)域的焦點(diǎn)微生物。本研究以分離自國(guó)內(nèi)低溫火腿中的上述兩株特定腐敗菌綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌[10]為研究對(duì)象，以乳酸鏈球菌素和超高壓作為柵欄因子，揭示二者協(xié)同處理對(duì)兩種菌存活率的影響，為降低工業(yè)化生產(chǎn)中的壓力水平，有效延長(zhǎng)低溫火腿的貨架期提供理論數(shù)據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色魏斯菌（Weissella viridescens）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides） 由16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果鑒定[10]，并通過(guò)Vitek2細(xì)菌全自動(dòng)鑒定儀（法國(guó)梅里埃）確認(rèn)；乳酸鏈球菌素 浙江銀象生物工程有限公司提供；革蘭氏染色液、MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 均購(gòu)自北京陸橋科技有限公司；0.22μm水系微孔濾膜 購(gòu)自天津東康科技有限公司；125mm×334mm型耐壓包裝袋 購(gòu)自北京華盾塑料有限公司。

超高壓設(shè)備UHPF/2L/800MPa 內(nèi)蒙古包頭科發(fā)高新技術(shù)食品機(jī)械公司；紫外分光光度計(jì)Spectrum723 上海光譜儀器有限公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；真空抽濾裝置 EHSY西域中國(guó)有限公司；高速冷凍離心機(jī)Allegra64R Beckman；生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS 上海申安醫(yī)療器械廠；連續(xù)點(diǎn)動(dòng)微型旋渦混合儀WH-2 上海滬西分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線的建立 采用比濁法[11]建立綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長(zhǎng)曲線。具體操作如下：將活化后的菌株按1%～3%的接種量無(wú)菌條件下接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)。每隔2h取樣，吸取5mL0.85%的生理鹽水對(duì)樣品離心洗脫，重復(fù)三次，最后加入5mL生理鹽水重懸菌液，生理鹽水作空白對(duì)照，600nm波長(zhǎng)下比色，記錄光密度值（OD值），以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌懸液OD值為縱坐標(biāo)，建立生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 乳酸鏈球菌素耐受實(shí)驗(yàn) 配制0.02%的檸檬酸溶液（pH3～4），以此作為溶劑配制50mg/mL的乳酸鏈球菌素貯存母液，使用0.22μm水系微孔濾膜過(guò)濾除菌，置4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

配制MRS瓊脂培養(yǎng)基，待其降至適宜溫度后在無(wú)菌條件下加入乳酸鏈球菌素貯存母液，分別調(diào)整其濃度為0、1、100、200、300、400、500μg/mL，充分混勻。取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的對(duì)象菌，以滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)液（pH6.0）洗脫，并調(diào)整綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數(shù)量分別至109、108cfu/mL。按照GB/T4789.2-2008操作，以上述添加乳酸鏈球菌素的MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行傾注培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃，48h，評(píng)價(jià)兩種菌對(duì)乳酸鏈球菌素的耐受程度。

1.2.3 超高壓處理 取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌體，以上述方法調(diào)整綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數(shù)量分別至109、108cfu/mL，將二者的MRS肉湯懸浮液分裝于無(wú)菌的聚酰胺/聚乙烯包裝袋，每袋2mL。熱封口，不留頂隙。分別采用0、100、200、300、400、500、600MPa的壓力超高壓處理5min，處理時(shí)間不包括升壓和卸壓的時(shí)間（傳壓介質(zhì)為葵二酸二辛酯液壓油）。處理時(shí)的油溫為20℃，升壓過(guò)程中油溫會(huì)上升，約1～2℃/ 100MPa。每組處理設(shè)兩個(gè)重復(fù)，處理完畢樣品放入盛有冰袋的泡沫箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，按照GB/T4789.2-2008進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 超高壓和乳酸鏈球菌素結(jié)合處理 于上述調(diào)整好綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數(shù)量的MRS肉湯懸浮液中添加乳酸鏈球菌素至其終濃度為200μg/mL，混合均勻，分裝，每袋2mL，包裝方法同上。每組設(shè)兩個(gè)重復(fù)，分別采用0、100、200、300、400、500、600MPa的壓力進(jìn)行超高壓處理5min，以未添加乳酸鏈球菌素且未受超高壓處理的樣品作空白對(duì)照。按照GB/ T4789.2-2008進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，培養(yǎng)條件同上。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SAS8.12進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗(yàn)（Plt;0.05），數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長(zhǎng)曲線

圖1顯示了接種后的綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌在MRS肉湯培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)變化情況。綠色魏斯菌在接種2h后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，12h后生長(zhǎng)速率開始下降，16～18h到達(dá)穩(wěn)定期，此時(shí)菌體數(shù)量也達(dá)到最大，之后進(jìn)入衰亡期開始下降；腸膜明串珠菌在接種4h后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)18h后進(jìn)入穩(wěn)定期，22h后進(jìn)入衰亡期。由二者的生長(zhǎng)曲線可見，綠色魏斯菌的延遲期相對(duì)較短，短時(shí)間內(nèi)數(shù)量增加到最大。大多數(shù)的研究表明，綠色魏斯菌適應(yīng)環(huán)境的能力比較強(qiáng)，是一種既能耐受熱處理又能耐受超高壓處理，同時(shí)還能耐受低濃度有機(jī)酸處理的腐敗微生物[9-10，12]。依據(jù)生長(zhǎng)曲線結(jié)果，確定綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的穩(wěn)定生長(zhǎng)期分別為培養(yǎng)16～18h和培養(yǎng)18～22h，以下抑菌實(shí)驗(yàn)均使用此時(shí)間段菌株作為對(duì)象菌種。

圖1 綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of W.viridescens and L.mesenteroides

2.2 乳酸鏈球菌素耐受實(shí)驗(yàn)

綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌對(duì)乳酸鏈球菌素的耐受程度見圖2。隨著乳酸鏈球菌素添加濃度的升高，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌生長(zhǎng)受到的抑制強(qiáng)度增大。腸膜明串珠菌對(duì)乳酸鏈球菌素的耐受性較差，200μg/mL的乳酸鏈球菌素能夠使該菌數(shù)量降低8lg（cfu/mL）；而綠色魏斯菌的耐受性較強(qiáng)。當(dāng)乳酸鏈球菌素含量上升至200μg/mL后，抑制程度不再發(fā)生顯著變化，近4lg（cfu/mL）的綠色魏斯菌存活。

由于能夠改變革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜的通透性而導(dǎo)致細(xì)胞自溶死亡[13-14]，乳酸鏈球菌素在食品特別是肉品中的應(yīng)用非常廣泛。綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌均屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，由圖2可知，乳酸鏈球菌素對(duì)二者表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果，尤其是對(duì)腸膜明串珠菌。然而，綠色魏斯菌仍有近4lg（cfu/mL）的存活，說(shuō)明綠色魏斯菌對(duì)乳酸鏈球菌素存在一定的耐受性，即使在500μg/mL的乳酸鏈球菌素濃度下，綠色魏斯菌仍然能夠生長(zhǎng)繁殖。

圖2 不同濃度乳酸鏈球菌素對(duì)綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的抑制效果Fig.2 Effect of Nisin on inhibition of W.viridescens and L.mesenteroides

2.3 超高壓和乳酸鏈球菌素的協(xié)同抑菌效果

表1列出了單獨(dú)超高壓處理以及添加200μg/mL乳酸鏈球菌素后超高壓處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。單獨(dú)超高壓處理時(shí)，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數(shù)量隨壓力升高均逐漸減少。綠色魏斯菌初始數(shù)量為9.04lg（cfu/mL）；壓力升高至400MPa時(shí)，開始顯著減少，近4lg（cfu/mL）受到抑制；繼續(xù)升高壓力至500MPa和600MPa時(shí)，綠色魏斯菌均表現(xiàn)出顯著減少的趨勢(shì)，在最高壓力600MPa時(shí)，綠色魏斯菌數(shù)量下降至2.35lg（cfu/mL）。腸膜明串珠菌對(duì)壓力的耐受性較差，壓力升高至300MPa時(shí)開始顯著減少，繼續(xù)升高壓力至500MPa時(shí)腸膜明串珠菌被完全抑制。添加200μg/mL乳酸鏈球菌素后進(jìn)行超高壓處理時(shí)，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌數(shù)量隨壓力升高而減少的幅度變大，且抑制效果并非簡(jiǎn)單的疊加，而是呈顯著的協(xié)同作用。乳酸鏈球菌素存在時(shí)，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌受到顯著抑制的壓力均降低到100MPa，二者分別在500MPa和400MPa時(shí)達(dá)到完全抑制。

表1 超高壓和乳酸鏈球菌素結(jié)合處理綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌Table1 The change of inhibition effect after adding Nisin at high pressure processing

綠色魏斯菌是超高壓肉制品中最常分離到的腐敗菌之一，能夠耐受600MPa甚至更高的壓力。Patterson等[15]在研究雞肉制品保藏中發(fā)現(xiàn)，綠色魏斯菌在600MPa，18℃，2min處理?xiàng)l件下細(xì)菌數(shù)量?jī)H有不到1lg（cfu/g）的減小。Diez等[9]的研究表明，綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌是超高壓處理的血腸制品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。本文的數(shù)據(jù)證實(shí)，分離自低溫?zé)熝鹜戎械木G色魏斯菌和腸膜明串珠菌同樣能夠耐受超高壓處理，單純超高壓處理無(wú)法徹底抑制綠色魏斯菌的生長(zhǎng)。

如何有效抑制此類微生物的生長(zhǎng)繁殖是學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界亟待解決的難題。目前報(bào)道的抑制手段主要包括超高壓結(jié)合熱處理[16]、有機(jī)酸[17]以及生物的或天然的抑菌成分[18-19]等。本研究采用超高壓和乳酸鏈球菌素作為柵欄因子，結(jié)果表明二者存在明顯的協(xié)同增效作用。前人的研究認(rèn)為[1，20]，超高壓抑制微生物生長(zhǎng)主要通過(guò)影響微生物細(xì)胞膜和細(xì)胞功能性蛋白實(shí)現(xiàn)。超高壓能夠?qū)е挛⑸锛?xì)胞發(fā)生不可逆的體積減小，從而引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)容物的流失（尤其在壓力保持階段），細(xì)胞死亡[21]；另一方面，細(xì)胞內(nèi)大量的聚合蛋白在超高壓作用下發(fā)生變性分離，微生物出現(xiàn)受傷或者死亡[22]。乳酸鏈球菌素的存在，導(dǎo)致細(xì)胞膜的去極化以及胞內(nèi)ATP的泄露，加劇了超高壓對(duì)細(xì)胞膜的作用。本研究證實(shí)，超高壓和乳酸鏈球菌素結(jié)合處理能夠有效抑制綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌的生長(zhǎng)繁殖。

3 結(jié)論

超高壓與乳酸鏈球菌素結(jié)合處理對(duì)分離自低溫火腿中的典型腐敗菌綠色魏斯菌和腸膜明串珠菌具有顯著的協(xié)同抑制作用，200μg/mL的乳酸鏈球菌素結(jié)合500MPa，5min，20℃的超高壓處理?xiàng)l件，能夠徹底抑制綠色魏斯菌的生物活性。乳酸鏈球菌素的添加能夠有效降低工業(yè)化生產(chǎn)中高壓力水平的使用。

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Combined effect of ultra high pressure and Nisin on inactivation of spoilage pressure-resistant bacteria isolated from smoked cooked ham

WEN Si-ying1，HAN Yan-qing2，F(xiàn)ANG Dong-lu1，CHEN Wei1，WU Ju-qing2，XU Xing-lian2，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.KeyLabofMeatProcessingandQualityControl，MinistryofEducation，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China）

The objective of this study was to evaluate the cooperate effect between high pressure and nisin content in inactivating pressure-resistant bacteria of cooked meat products.Typical spoilage pressure-resistant bacteria Weissella viridescens and Leuconostoc mesenteroides were treated with addition of 1～500μg/mL Nisin and also subjected to treatment at a range of high pressure from 100 to 600MPa（5min，20°C）.Standard culture methods were used to detecting the number of survivals.Results showed that，with the growing addition of nisin，numbers of the two bacteria were falling rapidly.When nisin content was up to 200μg/mL，these inactivate effect went to maximum.Significant reduction in bacteria numbers was found at high pressure treated at 400MPa and 300MPa for W.viridescens and L.mesenteroides，respectively.However，when high pressure treated with 200μg/mL Nisin，the pressure level fallen to 100MPa both for these two bacteria.High pressure treated at 500MPa for 5min at 20°C，with 200μg/mL Nisin content，could inactivate W.viridescens counts by 9lg（cfu/mL）.It provided evidence that there surely exist combined effect between high pressure and nisin when used for delaying bacteria grows.Nisin addition can effectively lower the pressure level used during industrial decontamination processes.

ultra high pressure；Nisin；pressure-resistant bacteria

TS251.1

A

1002-0306（2012）01-0059-04

2011－02－14 *通訊聯(lián)系人

溫斯穎（1991-），女，本科，研究方向：食品科學(xué)與工程。

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃課題（101030723）；江蘇省普通高校研究生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CX10B_310Z）。