趙 麗，徐淑萍，李宗陽，張 蕾，張澤生，潘瑞樂，*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京100193；2.天津科技大學(xué)，天津300457）

楊梅素及其類似物抗氧化與乙酰膽堿酯酶抑制活性研究

趙 麗1，2，徐淑萍1，李宗陽1，張 蕾2，張澤生2，潘瑞樂1，*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京100193；2.天津科技大學(xué)，天津300457）

目的：探討楊梅素、楊梅苷及二氫楊梅素的抗氧化和乙酰膽堿酯酶抑制活性。方法：采用DPPH自由基清除和乙酰膽堿酯酶抑制高通量篩選模型進(jìn)行研究。結(jié)果：楊梅素、楊梅苷和二氫楊梅素清除DPPH自由基的IC50值分別為18.34、28.89、10.70μg/mL，三種化合物的抗氧化活性均強(qiáng)于陽性藥蘆?。↖C50=31.32μg/mL），其中二氫楊梅素還強(qiáng)于VC（IC50=14.69μg/mL）；在質(zhì)量濃度為0.25mg/mL時，楊梅素、楊梅苷和二氫楊梅素對乙酰膽堿酯酶的抑制率分別為：30.66%±4.05%、38.48%±1.98%、78.81%±2.23%，其中二氫楊梅素對乙酰膽堿酯酶抑制作用較顯著，其IC50值為1546± 47.05μmol/L。結(jié)論：楊梅素、楊梅苷、二氫楊梅素均具有顯著的DPPH自由基清除能力，本文首次報(bào)道二氫楊梅素具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性，值得進(jìn)一步深入研究。

楊梅素，楊梅苷，二氫楊梅素，DPPH自由基清除活性，乙酰膽堿酯酶抑制活性

阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s Disease，AD）多發(fā)生于老年和老年前期，又稱早老性癡呆癥，是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性病變。隨著人口老齡化，AD已經(jīng)成為繼心血管疾病和腫瘤之后嚴(yán)重威脅老年人生命健康的主要疾病之一[1]。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其中膽堿能神經(jīng)元丟失和自由基氧化損傷可能是其主要發(fā)病機(jī)制[2-3]。膽堿能損傷學(xué)說表明，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水平明顯降低，臨床多采用乙酰膽堿酯酶抑制劑，抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，ACHE）降解乙酰膽堿，從而提高乙酰膽堿水平的方法治療AD[4-5]。美國FDA批準(zhǔn)的5種臨床治療AD的藥物中4種為乙酰膽堿酯酶抑制劑[6]，表明抑制乙酰膽堿酯酶活性仍不失為一種有效的AD治療途徑。自由基假說表明，AD患者的腦內(nèi)還出現(xiàn)氧含量偏高，氧化應(yīng)激損傷較顯著的現(xiàn)象[7]，可通過使用抗氧化劑輔助治療，改善患者腦內(nèi)自由基消除系統(tǒng)的缺陷。已有體外實(shí)驗(yàn)顯示，維生素E可保護(hù)培養(yǎng)的神經(jīng)元抵抗β-淀粉樣蛋白的侵害作用，能延緩AD的進(jìn)程，同時建議將抗氧化劑與膽堿酯酶抑制劑合用，通過清除自由基以及抑制乙酰膽堿酯酶的活性來達(dá)到協(xié)同治療AD的目的[8]。楊梅素、楊梅苷及二氫楊梅素具有較強(qiáng)抗氧化活性[9-11]，但大多只是采用紫外分光光度法進(jìn)行活性比較。本文采用了DPPH自由基清除微量模型進(jìn)行高通量篩選，根據(jù)IC50值和TEAC（Trolox Equivalent Antioxidant Capacity，Trolox當(dāng)量）精確定量其抗氧化能力。并在此基礎(chǔ)上，初步探討了楊梅素、楊梅苷、二氫楊梅素的乙酰膽堿酯酶抑制活性，旨在篩選出抗氧化和乙酰膽堿酯酶抑制活性均較好的物質(zhì)，為研發(fā)治療AD的新藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品 楊梅素、二氫楊梅素為本課題組從植物藤茶中分離得到，楊梅苷為從楊梅樹皮中分離得到，經(jīng)UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR光譜分析鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC純度檢測在95%以上（面積歸一化法）；乙酰膽堿酯酶 來源于C57BL/6J品系正常雄性鼠，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心；碘化硫代乙酰膽堿、他克林、DTNB（5，5’-二硫雙硝基苯甲酸）、十二烷基硫酸鈉、DPPH、trolox 均購自Sigma公司；PBS磷酸緩沖鹽溶液 購自索萊寶生物科技公司；蘆丁、維生素C、氫溴酸加蘭他敏、鹽酸多奈哌齊 購自中國藥物生物制品檢定所；其它化學(xué)試劑 均為分析純，購自北京化工廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DPPH自由基清除微量模型的篩選方法

1.2.1.1 trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以trolox（6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸，一種合成的類似于VE的水溶性物質(zhì)）作為自由基反應(yīng)的參比物，考察篩選模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

精密稱取trolox粉末2.8mg，2mL甲醇溶解，配制成1400μg/mL的樣品溶液，倍比稀釋成70、56、40、32、25、12.5、6.25μg/mL的系列濃度，分別吸取50μL加入96孔板中，加入250μmol/L的DPPH甲醇溶液150μL，對照組用50μL甲醇代替樣品溶液，空白組用150μL甲醇代替DPPH溶液，充分振蕩混勻，37℃孵育30min，515nm處測其吸光值，按下列公式計(jì)算自由基清除率，求得IC50值。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A樣本-A空白）/A對照]×100% 1.2.1.2 DPPH自由基清除微量模型的篩選 蘆丁、VC作為對照品，trolox作為自由基反應(yīng)的參比物，DPPH自由基清除率測定和IC50值計(jì)算方法同1.2.1.1。

1.2.2 乙酰膽堿酯酶活性的高通量篩選方法 采用改良的Ellman方法[12]建立乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選體系，以陽性藥他克林作為參照驗(yàn)證體系的合理性。

以小鼠全腦10%勻漿作為乙酰膽堿酯酶酶液，反應(yīng)體系中加入32μL酶液、160μL系列濃度的他克林或樣品溶液（對照組抑制劑為1.25%DMSO）和400μL顯色劑DTNB（空白組在加DTNB后加入400μL SDS終止反應(yīng)），補(bǔ)水至1.2mL，37℃孵育5min，加入底物ATCH（碘化硫代乙酰膽堿）37℃孵育15min，加入400μL SDS終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在412nm處測定吸光度值。根據(jù)以下公式計(jì)算乙酰膽堿酯酶抑制率，并求其IC50值。根據(jù)陽性藥的IC50值判斷篩選體系是否合理。

乙酰膽堿酯酶抑制率（%）=[1-（A樣本-A空白）/（A對照-A空白）]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

每個濃度3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制當(dāng)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，三次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，trolox的IC50平均值為37.55μg/mL，RSD為2.37%，說明該方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

圖1 三次實(shí)驗(yàn)trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of trolox

2.2 楊梅素及其類似物DPPH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 樣品與trolox、陽性藥抗氧化能力對照表Table 1 The antioxidant activities of sample and positive drugs

圖2 DPPH自由基清除微量模型篩選結(jié)果Fig.2 DPPH free radical-scavenging assay

楊梅素、楊梅苷及二氫楊梅素的DPPH自由基清除能力的IC50分別為：18.34、28.89、10.70μg/mL，明顯強(qiáng)于蘆?。↖C50=31.32μg/mL），其中二氫楊梅素還強(qiáng)于VC（IC50=14.69μg/mL）。以trolox為參比物，計(jì)算了陽性藥及供試藥的TEAC值（即每克抗氧化物質(zhì)的自由基清除能力相當(dāng)于Trolox的自由基清除能力的微摩爾數(shù)），見表1。DPPH清除率與樣品濃度的相關(guān)性見圖2。

2.3 楊梅素及其類似物乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選結(jié)果

2.3.1 陽性藥的驗(yàn)證結(jié)果 以他克林不同倍比稀釋濃度與乙酰膽堿酯酶抑制率作相關(guān)性曲線，得出他克林的IC50=1158±25.09nmol/L（見表2）。與文獻(xiàn)[13]報(bào)道他克林的IC50值=1.15×10-6mol/L基本一致，說明該篩選體系穩(wěn)定可靠。

表2 陽性藥他克林的乙酰膽堿酯酶抑制作用（n=3）Table2 Theacetylcholinesteraseinhibitoractivityoftacrine（n=3）

2.3.2 楊梅素及其類似物的乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選 在0.25mg/mL濃度下，楊梅素、楊梅苷及二氫楊梅素對乙酰膽堿酯酶的抑制率分別為：30.658%± 4.048%、38.477%±1.984%、78.81%±2.23%，其中二氫楊梅素的乙酰膽堿酯酶抑制效果較為顯著（見圖3）。鑒于二氫楊梅素對乙酰膽堿酯酶有較好的抑制效果，進(jìn)一步對二氫楊梅素溶液倍比稀釋成不同濃度進(jìn)行篩選，求得其IC50值為1546±47.05μmol/L（見表3）。

圖3 乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選結(jié)果Fig.3 Acetylcholinesterase inhibitor activity assay

表3 二氫楊梅素的乙酰膽堿酯酶抑制作用（n=3）Table 3 The acetylcholinesterase inhibitory activity of dihydromyricetin（n=3）

3 討論

楊梅素、楊梅苷、二氫楊梅素均屬于多羥基黃酮類化合物，楊梅苷（3'，4'，5'，5，7-五羥基黃酮-3-O-α-L-鼠李糖苷）是由楊梅素（3，5，7，3'，4'，5'-六羥基黃酮）的3號位上連接一個鼠李糖苷而形成的黃酮苷類化合物，而二氫楊梅素（3，5，7，3'，4'，5'-六羥基-2，3雙氫黃酮醇）是由楊梅素的2、3位上加氫而形成的雙氫黃酮醇類化合物，三者3'，4'，5'具有的酚羥基是親核取代反應(yīng)易發(fā)生部位[14]，已有較多文獻(xiàn)證實(shí)三者均具有顯著的抗氧化活性。

DPPH自由基的清除能力可反映藥物的抗氧化活性，傳統(tǒng)大多采用分光光度法測定，一次只能測一組數(shù)據(jù)，操作繁瑣，準(zhǔn)確性差。本文采用DPPH自由基清除微量模型，以trolox作為自由基反應(yīng)的參比物，用酶標(biāo)儀一次測定多組樣品數(shù)據(jù)，樣本用量小，測定快速準(zhǔn)確，尤其適用微量天然產(chǎn)物抗氧化活性的篩選[15]。

楊梅素、楊梅苷、二氫楊梅素活性已有很多研究[16-18]，但乙酰膽堿酯酶抑制活性目前未見報(bào)道。本研究采用乙酰膽堿酯酶抑制活性高通量篩選模型對楊梅素、楊梅苷、二氫楊梅素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，楊梅素、楊梅苷對乙酰膽堿酯酶抑制抑制活性較弱，二氫楊梅素抑制活性較顯著，其IC50值為1546±47.05μmol/L。二氫楊梅素由于引入氫原子后，分子結(jié)構(gòu)的柔性增加，分子作用力減弱，水溶性比楊梅素增加，可能是其活性較好的原因之一。

目前批準(zhǔn)上市的臨床常用AchE抑制劑主要有他克林（tacrine）、多奈哌齊（donepezil）、卡巴拉汀（rivastigmine）、加蘭他敏（galantamine）和石杉堿甲（huperzine A）等，但都伴隨著不同程度的不良反應(yīng)，主要副作用是胃腸道反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、厭食等，其它少見的副作用是失眠和抑郁加重，他克林尚有肝毒性，在中國市場已停用[19]，因此尋找療效顯著、無副作用的治療AD的天然活性成分具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究結(jié)果顯示，二氫楊梅素同時具有較強(qiáng)乙酰膽堿酯酶抑制及抗氧化活性，可以作為治療AD的天然產(chǎn)物或先導(dǎo)化合物進(jìn)行深入的研究。

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Study on the antioxidant and antiacetylcholinesterase activities of myricitrin and its structure-similar compounds

ZHAO Li1，2，XU Shu-ping1，LI Zong-yang1，ZHANG Lei2，ZHANG Ze-sheng2，PAN Rui-le1，*
（1.InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Objective：To investigate the antioxidant and acetylcholinesterase inhibitory activities of myricetin，myricitrin and dihydromyricetin in vitro.Methods：A high-throughput screening assay for 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）free radical-scavenging and acetylcholinesterase inhibitory activity were used.Results：The antioxidant activities of three compounds were excellent and better than the postive drug Rutin（IC50= 31.32μg/mL）.The IC50values of three compounds were 18.34，28.89，10.70μg/mL respectively，among them the free radical-scavenging activity of dihydromyricetin even better than the other positive drug Vitamin C（IC50= 14.69μg/mL）.Under the concentration of 0.25mg/mL，the acetylcholinesterase inhibition rates of myricetin，myricitrin，dihydromyricetin were 30.66%±4.05%，38.48%±1.98%，78.81%±2.23%respectively，in which the acetylcholinesterase inhibitory activity of dihydromyricetin was the most significant and the IC50value was 1546±47.05μmol/L.Conclusion：The DPPH free radical-scavenging activities of myricetin，myricitrin，and dihydromyricetin were all significant.Furthermore，the acetylcholinesterase inhibitory activity of dihydro-myricetin was the first reported，it was worth for further study.

myricetin；myricitrin；dihydromyricetin；DPPH free radical-scavenging activity；acetylcholinesterase inhibitory activity

TS255.1

A

1002-0306（2012）01-0056-04

2011－01－10 *通訊聯(lián)系人

趙麗（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品分析。

創(chuàng)新藥物研究開發(fā)技術(shù)平臺建設(shè)（2009ZX09301-003）；國家支撐計(jì)劃（2007BAI27B05）。