李 倩，蒲 彪

(四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014)

響應面法優(yōu)化花椒香氣成分的HS-SPME萃取條件的研究

李 倩1，蒲 彪2，*

(四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014)

為了優(yōu)化花椒香氣成分HS－SPME萃取，在單因素實驗的基礎上，利用Box－Benhnken的中心組合實驗設計原理，以提取物質的質(色)譜圖總峰面積為考察指標，對萃取溫度、萃取時間、原料用量進行3因素3水平響應面分析。結果表明，萃取溫度對總峰面積有顯著影響，萃取時間和原料用量對其影響不顯著;萃取時間和原料用量的交互作用顯著，其它交互作用均不顯著;得到萃取花椒香氣成分最佳的工藝條件為:萃取溫度55.97℃，萃取時間30.73min，原料用量3.15g，在此條件下，香氣成分總峰面積為2.21101×109。

花椒，頂空固相微萃取，香氣成分，響應面分析，中心組合設計

花椒是指蕓香科植物花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)和青椒(Zanthoxylum schinlfolium Sieb et Zucc)的干燥成熟果皮［1］，是我國特有的一種香辛料。目前，對花椒的研究主要集中在以下幾個方面:花椒種植與栽培及病蟲害防治研究、花椒主要化學成分及含量、花椒的藥理研究等。作為一種傳統的香辛料，我國對花椒的良種選育及加工產品開發(fā)相對滯后，而對其發(fā)香機理、香氣成分的組成與變化等的理論研究也十分有限。我國的花椒資源豐富，對其香氣進行研究可以為花椒精深加工提供理論依據，創(chuàng)造更大的經濟價值。目前，花椒香氣物質的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法［2］、溶劑萃取法［3］、超臨界CO2萃取法［4］、同時蒸餾萃取法［5］。固相微萃取法在花椒香氣的萃取中還未見報道。固相微萃取法無需有機溶劑，分析樣品量少，克服了以上幾種預處理方法的缺點，操作簡單、快速，費用低，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，能夠盡可能地減少被分析的香氣物質的損失［6］。因此本實驗采用固相微萃取法萃取花椒香氣。響應面法(response surface methodology，RSM)是20世紀90年代初興起的一種實驗統計方法。它囊括了實驗設計、建模、檢驗模型的合適性，尋求最佳組合條件等眾多實驗和統計技術。通過對方程的回歸擬合和響應曲面、等高線的繪制，可方便地求出相應于各因素水平的響應值［7］。本研究在單因素實驗的基礎上，選取萃取溫度、萃取時間及原料用量為影響因素，以萃取物質離子色譜圖峰面積為考察指標，對頂空固相微萃取花椒香氣成分的條件進行優(yōu)化，以達到最佳萃取效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四川洪雅青花椒 7月中旬采摘于四川省洪雅縣洪川鎮(zhèn)共同村老朱山，采摘后的青花椒裝在透氣的泡沫箱子里，一層花椒一層葉，用空調車運送至實驗室;無水乙醚 AR，四川西隴化工有限公司。

100μmPDMS萃取頭、手動 SPME進樣手柄、15mL帶硅橡膠墊的樣品瓶 美國Supelco公司;島津GCMS－QP2010Puls氣質聯用儀、島津GC－2010氣相色譜儀 日本島津公司;DHG－9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;BT－124S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司; FW100高速萬能粉碎機，40目篩網。

1.2 實驗方法

1.2.1 原材料預處理 將青花椒去梗、去雜質，置于50℃的烘箱中干燥，干燥后青花椒置于粉碎機中粉碎并過40目篩，備用。

1.2.2 萃取頭老化 將首次使用的100μm PDMS固相微萃頭在氣相色譜的進樣口老化至無雜峰，老化溫度250℃，時間1h。以后每次使用前均在此溫度下老化30min。

1.2.3 萃取方法 將花椒原料烘干粉碎過40目，稱取一定量的花椒粉末置于15mL的樣品瓶中，在預先設定好溫度的水浴中保溫10min，將老化好的固相微萃取針插入樣品瓶中大約1cm處(不要接觸到樣品，以免污染針頭)，推出萃取頭，在設定溫度下頂空吸附預制時間，收進萃取頭后，拔出針頭，迅速置于插入氣相進樣口(另外萃取頭每次插入襯管的長度需保持不變，一般可利用固相微萃取自帶的橡膠圈將針頭伸出長度固定到1.5cm左右，確保實驗的可重復性)，250℃下解析5min。

1.2.4 GC－MS檢測條件 GC條件:DB－5MS毛細管柱(30m×0.25μm×0.25nm);進樣口溫度240℃;程序升溫:50℃持續(xù)3min，以2℃/min升至70℃，再以1℃/min升至 90℃持續(xù) 2min，再以 2℃/min升至150℃，最后以5℃/min升至250℃持續(xù)10min;載氣:高純氦氣，流量1mL/min，分流比40∶1;檢測器:氫火焰離子檢測器(FID);燃氣:H2，流量50mL/min;助燃氣:空氣，500mL/min。

MS條件:EI+離子源;離子能量70eV;燈絲電流量0.20mA;離子源溫度230℃;接口溫度240℃;掃描質量范圍10～500amu。

1.2.5 數據分析 數據收集用化學工作站軟件對照NIST library譜庫進行，成分先由譜庫初步鑒定，然后積分得到總峰面積。

1.3 實驗設計

1.3.1 單因素實驗設計

1.3.1.1 萃取溫度的確定 將原料用量和萃取時間固定，按照1.2.3方法分別在30、40、50、60、70℃的水浴溫度下萃取，通過比較GC/MS中總峰面積來確定最佳的萃取溫度。

1.3.1.2 萃取時間的確定 將原料用量和萃取時間固定，按照1.2.3方法分別萃取10、20、30、40、50min。通過比較GC/MS中總峰面積來確定最佳的萃取時間。

1.3.1.3 原料用量的確定 將萃取溫度和萃取時間固定，稱取1、2、3、4、5g的花椒粉末置于15mL的樣品瓶中，按照1.2.3方法進行萃取。通過比較GC/MS總峰面積來確定最佳的原料用量。

1.3.2 響應面實驗 在單因素實驗基礎上，采用Box－Behnken中心組合設計原理，對影響響應值(總峰面積)的3個因素原料用量(X1)、萃取溫度(X2)、萃取時間(X3)進行考察，設計因素水平編碼表見表1。所得實驗結果采用Design Expert7.1.3軟件進行分析。

1.3.3 驗證實驗 將通過Design Expert7.1.3軟件分析所得萃取花椒香氣成分的最佳參數條件，按照

1.2.3 方法進行實驗驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素對總峰面積的影響

2.1.1 萃取溫度對總峰面積的影響 在固相微萃取中，當基質為固態(tài)時，溫度是影響平衡的最主要因素。萃取溫度對SPME的影響具有雙重效應:通過升高溫度，可以加快分子熱運動，提高分子擴散速度(提高分析物在頂空的分配)，縮短平衡時間、加快分析速度，尤其對于頂空固相微萃取;但溫度過高會使分析物在涂層與基質中的分配系數降低，涂層對分析物的吸附量減小，從而影響SPME的靈敏度［8］。同時由于很多風味物質都是熱化學性質不穩(wěn)定的化合物，當萃取溫度過高時，易發(fā)生化學變化，例如萃取頭固有組分的解析等，從而降低了萃取頭的吸附分析組分的能力，導致分析結果失真。因此，萃取溫度在固相微萃取過程中起到的兩方面作用均應被考慮。

由圖1可以看出，隨著溫度的升高，吸附量逐漸上升，當萃取溫度50℃時，所檢測的總峰面積達到最大，隨著溫度的繼續(xù)上升，吸附量呈逐漸下降的趨勢。當萃取溫度30℃時所檢測到的總峰面積較小，這是由于溫度較低時不利于風味化合物的揮發(fā)，頂空中的化合物的量較少，而加熱能提高各物質特別是低揮發(fā)性成分物質在頂空中的濃度;隨著溫度的升高，頂空各物質的濃度也有所提高，當到達50℃時，萃取化合物的量達到最大;但由于萃取頭的吸附反應是一個放熱的過程，溫度升高在提高頂空各物質的濃度的同時也降低了涂層的分配系數，特別是易揮發(fā)性的小分子的分配系數，故在溫度達到60℃時，萃取頭的吸附效果有所下降;在溫度繼續(xù)升高到70℃時，萃取頭的吸附效果明顯變差，這可能是由于溫度升高導致固體花椒粉末中水分在纖維頭上凝結成水滴，從而大大降低了萃取頭對化合物的吸附，同時由于許多風味物質都是熱化學性質不穩(wěn)定的化合物，在溫度升高時，這些化合物易發(fā)生化學變化，產生后生產物，導致分析結果的失真。綜合考慮諸多因素，選用50℃的溫度較合適。

2.1.2 萃取時間對總峰面積的影響 不同的樣品到達萃取平衡的時間是不同的，所以存在吸附與解吸附平衡的最佳時間。影響萃取時間的因素主要有萃取頭的選擇、分配系數、樣品的擴散系數、頂空體積、樣品萃取的溫度等。萃取開始時萃取頭固定相中物質的濃度增加很快，接近平衡時速度就極其緩慢，但在平衡之前萃取頭涂層中吸附的物質量與其最終濃度就已存在一個比例關系，所以在接近平衡時就可以完成萃取過程［9］。

圖1 萃取溫度對總峰面積的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on the peak area

由圖2可以看出，隨著時間的延長，吸附量逐漸上升，當萃取時間為30min時，所檢測的總峰面積達到最大，隨著時間的繼續(xù)延長，吸附量呈逐漸下降的趨勢。當萃取時間為10min時，萃取頭的吸附－解析還沒有達到平衡狀態(tài)，所檢測到的峰面積較小;當萃取時間為30min時，總峰面積最大;但隨著時間的繼續(xù)延長到40min后，由于萃取時間過長會導致萃取頭固有組分的流失，導致萃取能力下降，吸附的量反而降低。表明總峰面積受萃取時間的影響，并且萃取時間應該有一個最佳值存在。綜合考慮選擇萃取的時間為30min較為合適。

圖2 萃取時間對總峰面積的影響Fig.2 Effects of extraction time on the peak area

2.1.3 原料用量對總峰面積的影響 對于頂空萃取法，組分的萃取量與該組分在基質及萃取頭涂層之間的分配系數有關［10］。試樣量增大，重現性變好，檢出量也隨之提高。但是當萃取容器體積一定時，同一濃度的樣品體積增加，會使相應的頂空體積減少，萃取量隨著頂空體積與樣品體積比例的減少呈現先增加后降低的趨勢，因而頂空萃取時存在一個適宜的頂空－樣品體積。

由圖3可以看出，隨著原料用量的增加，吸附量逐漸上升，原料用量為3g時，所檢測的總峰面積達到最大，隨著原料用量的繼續(xù)增加，吸附量呈逐漸下降的趨勢。表明總峰面積受原料用量的影響，并且原料用量應該有一個最佳值存在，根據圖3選擇原料用量為3g。

圖3 原料用量對總峰面積的影響Fig.3 Effects of extraction sampling volume on the peak area

2.2 響應面法優(yōu)化萃取條件得到最大總峰面積

2.2.1 響應面法因素水平及實驗方案 實驗設計及結果見表2。

表2 Box－Behnken實驗設計及結果Table 2 Box－Behnken design and results

實驗共有15個實驗點，實驗號1～12是析因實驗點，實驗號13～15是零實驗點，其中析因點為自變量在X1、X2、X3所構成的三維頂點;零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復3次，用以估計實驗誤差［11］。

2.2.2 香氣成分提取工藝模型建立及其顯著性檢驗利用Design Expert軟件，對表2的實驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到二次多元回歸方程如下:

對模型進行方差分析，結果見表3。由表3可以看出:模型F=19.28，P=0.0023＜0.01表明模型是高度顯著的;失擬項F=6.28，P=0.1404＞0.05，說明模型失擬度不顯著;模型的調整系數=0.9216，說明該模型能解釋92.16%響應值的變化，因而擬合度良好，實驗誤差小，可以用于SPME萃取條件優(yōu)化的理論預測。對模型進行回歸方程系數顯著性檢驗可知:一次項X1萃取溫度極為顯著，其他兩項均不顯著;交互項X2X3顯著;平方項顯著，均極顯著。因此各個因素對總峰面積的影響不是簡單的線性關系。各因素影響大小排序依次為:萃取溫度＞原料用量＞萃取時間，即X1＞X3＞X2。

依據方差分析結果，剔除不顯著項，簡化后的回歸方程為:

表3 回歸分析結果Table 3 Results of regression analysis

2.2.3 響應面分析及優(yōu)化 各因素間交互作用對總峰面積的響應面分析［12－13］通過Design Expert 7.1.6軟件實現。根據回歸分析結果作出響應曲面，見圖4～圖6。

圖4 萃取溫度(X1)和萃取時間(X2)交互作用的響應面Fig.4 Response surface graph of total peak area as a function of extraction temperature and extraction time

圖5 萃取溫度(X1)和原料用量(X3)交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface graph of total peak area as a function of extraction temperature and sampling volume

圖6 萃取時間(X2)和原料用量(X3)交互作用的響應面圖Fig.6 Response surface graph of total peak area as a function of extraction time and sampling volume

由圖4可知，在因素所考察的范圍內總峰面積隨著萃取溫度的增加呈現先增大后減小的趨勢，萃取溫度為55℃左右為轉折點;隨萃取時間的增加亦呈現先增大后減小的關系，轉折點為30℃左右。由圖5、圖6可知，萃取溫度和萃取原料用量、萃取時間和原料用量對總峰面積的影響均呈現先增加后減小的關系，且原料用量的最大值出現在3g左右。

由Design－Expert軟件分析得到的最大響應值(Y)時對應的編碼值分別為Xl=55.97，X2=30.73，X3=3.15，此時Y=2.21101×109;轉化為實際參數，即在萃取溫度55.97℃，萃取時間30.73min，原料用量3.15g，總峰面積高達2.21101×109。

為檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化萃取條件進行HS－SPME萃取青花椒香氣，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數修正為:萃取溫度56℃，萃取時間31min，原料用量3g。在此條件下提取3次，實際測得的平均總峰面積為2.19901×109，實測值是理論值的99.46%。因此，實驗結果表明此萃取條件是可行的。

3 結論

3.1 采用實驗設計軟件 Design Expert 7.1.6，通過Box－Behnken中心組合實驗設計得到了總峰面積與萃取時間、萃取溫度、原料用量的回歸模型，方差分析結果表明該模型極顯著，校正確定系數達0.9216，失擬項不顯著，說明該方程能很好的預測HS－SPME萃取花椒香氣總峰面積隨各參數變化的規(guī)律。

3.2 利用模型的響應面及等高線，對影響HS－SPME萃取花椒香氣成分的關鍵因素及其相互作用進行探討，得到的優(yōu)化工藝參數為:萃取溫度55.97℃，萃取時間30.73min，原料用量3.15g?？紤]到操作的便利，對此條件進行適當修正后，實際測得的平均總峰面積為2.19901×109，實測值是理論值的99.46%。因此，用響應面分析方法對HS－SPME萃取花椒香氣的工藝進行優(yōu)化，可以獲得最優(yōu)的工藝參數，有效地減少工藝操作的盲目性，從而為進一步的實驗研究奠定理論基礎。

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Optimization of component HS－SPME extraction from Zanthoxylum bumgeanum Maxim by response surface methodology

LI Qian1，PU Biao2，*
(College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

For optimization of component extraction from Zanthoxylum bumgeanum Maxim，the extraction conditions were investigated by using single factor and response surface methodology based on Box－Benhnken central design principles，in which the total peak area of extract mass spectrum was used as response value.The results showed that significant effects were detected through extraction temperature，the interaction of the extraction time and sampling volume.The optimum conditions were as follows:extraction temperature 55.97℃，extraction time 30.73min and sampling volume 3.15g，under this condition，the total peak area was 2.21101×109.

Zanthoxylum bumgeanum Maxim;HS－SPME;aroma component;response surface methodology; central composite design

TS264.3

B

1002－0306(2012)02－0334－05

2011－03－21 *通訊聯系人

李倩(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品微生物與發(fā)酵。