楊延存，王靜鳳，李曉林，張 珣，楊玉紅，薛長(zhǎng)湖

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003)

海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)機(jī)制的研究

楊延存，王靜鳳，李曉林，張 珣，楊玉紅，薛長(zhǎng)湖*

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003)

目的:研究海參蟲(chóng)草復(fù)劑(Apostichopus japonicus and Cordyceps militaris，AC)對(duì)鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟功能的保護(hù)作用。方法:采用一次性腹腔注射STZ 60mg/kg建立大鼠糖尿病模型，在長(zhǎng)期高血糖環(huán)境下造成對(duì)腎臟的損傷。糖尿病大鼠分為海參蟲(chóng)草復(fù)劑低劑量組和高劑量組，灌胃劑量分別為300、1200mg/kg·bw，8周后分別檢測(cè)大鼠腎肥大指數(shù)、尿中總蛋白、微量白蛋白(Microalbuminuria，mAlb)和N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶(N－acetyl－β－D－Glucosaminidase，NAG)含量，并取腎皮質(zhì)對(duì)其結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行顯微和亞顯微觀察。結(jié)論:海參蟲(chóng)草復(fù)劑能顯著防止糖尿病腎病大鼠腎小球肥大、降低mAlb與NAG排泄率、降低腎小管內(nèi)溶酶體數(shù)量、減輕腎小管的腫脹程度、保護(hù)腎小管刷狀緣結(jié)構(gòu)，說(shuō)明海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)糖尿病大鼠腎臟的結(jié)構(gòu)和功能具有顯著的保護(hù)作用。

日本刺參，蛹蟲(chóng)草，糖尿病腎病，腎小球基底膜

糖尿病腎病(Diabetes nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病病人致殘和減壽的主要原因之一［1］。因此如何有效防治DN是當(dāng)前糖尿病和腎臟病學(xué)者們共同面臨的一個(gè)重要任務(wù)［2］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)海參營(yíng)養(yǎng)成分的研究表明，海參富含各種人體所需的氨基酸、維生素、脂肪酸以及常量和微量元素，幾乎不含膽固醇［3］，并且含有海參皂苷、海參多糖、膠原蛋白等活性成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、調(diào)節(jié)血脂、延緩衰老等功效。蛹蟲(chóng)草，又稱(chēng)北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草等，是冬蟲(chóng)夏草的近緣種，其味甘、性平，有益肺腎、補(bǔ)精髓、止血化痰的功能［4］。研究表明，蛹蟲(chóng)草含有蟲(chóng)草酸、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖、蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶、維生素及多種微量元素，與冬蟲(chóng)夏草的化學(xué)成分基本相同且功效相近，具有提高免疫力、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多方面藥理作用［5－8］。海參和蟲(chóng)草對(duì)腎臟的保護(hù)作用近年來(lái)逐漸受到關(guān)注。將二者配藥具有大補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)腎益肺、養(yǎng)血生精之功效。本實(shí)驗(yàn)將海參和蟲(chóng)草制成復(fù)劑灌胃經(jīng)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠，研究其對(duì)糖尿病大鼠腎臟功能的調(diào)節(jié)作用，并對(duì)其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行深入探討，為其合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康SD大鼠 雄性，體重(200±20)g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為 SCXK(京)2007－0001;干制日本刺參(Apostichopus japonicus)、蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)均由市場(chǎng)購(gòu)得，分別經(jīng)超微粉碎后，按2∶1的比例混合制成海參蟲(chóng)草復(fù)劑(AC)，室溫儲(chǔ)存;蒸餾水配制成所需濃度懸濁液;STZ 美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;尿微量白蛋白測(cè)試盒 上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;葡萄糖試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品;β－N乙酰葡萄糖苷酶測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio－Rad公司;TGL－16G型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HW.SY11－K電熱恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表廠;WFJ2000型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司; BH－2正置顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5d，隨機(jī)取出10只作為正常對(duì)照組，其余大鼠禁食不禁水12h，一次性腹腔注射STZ 60mg/kg·bw(臨用前溶解于pH=4.3、0.1mmol/L的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液，終濃度為2%)。正常對(duì)照組大鼠注射等體積檸檬酸緩沖液。繼續(xù)飼養(yǎng)3d后，禁食不禁水5h，尾靜脈采血，測(cè)空腹血糖值，以血糖值≥16.7mmol/L者為造模成功。

將造模成功的大鼠按照體重及血糖值隨機(jī)分為3組:模型對(duì)照組、海參蟲(chóng)草復(fù)劑低、高劑量組，每組10只。劑量組灌胃海參蟲(chóng)草復(fù)劑(分別為 300、1200mg/kg·bw)，正常和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水。灌胃體積均為10mL/kg·bw，1次/d，共8周。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食普通飼料和飲水。

1.2.2 腎肥大指數(shù)測(cè)定 大鼠麻醉后摘取雙腎，稱(chēng)重，并計(jì)算腎臟肥大指數(shù):腎臟肥大指數(shù)(%)=雙側(cè)腎臟重量之和/體重×100%。

1.2.3 尿中總蛋白、微量白蛋白(mAlb)含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4d，大鼠于代謝籠中單只飼養(yǎng)，收集24h尿液，記錄尿液總體積。取一定量尿液離心，上清液于－20℃凍存。尿中總蛋白含量采用雙縮脲法測(cè)定。mAlb含量參照試劑盒方法檢測(cè)。

1.2.4 尿液中 N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶(N－acetyl－β－D－Glucosaminidase，NAG)活力測(cè)定在400nm處測(cè)NAG水解產(chǎn)物的吸光度，并計(jì)算酶活力單位。酶活力單位(U/L)=(測(cè)定管OD值－對(duì)照管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值－空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/15×1000，尿液中NAG含量參照試劑盒方法檢測(cè)，并計(jì)算其排泄率=尿液中NAG含量×24h尿量。

1.2.5 腎臟的組織學(xué)觀察 大鼠于末次給藥后禁食不禁水10h，稱(chēng)重后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉(劑量為35mg/kg·bw)，經(jīng)心臟插管注入4℃預(yù)冷生理鹽水灌洗至腎臟顏色發(fā)白后，取腎皮質(zhì)于10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm切片。切片經(jīng)HE染色，于顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.6 透射電鏡觀察 取大鼠腎皮質(zhì)，切取體積為1mm3的組織塊，用2.5%戊二醛緩沖液固定，常規(guī)透射電鏡制樣，超薄切片，透射電鏡觀察。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)進(jìn)行LSD比較，以＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)腎臟肥大指數(shù)的影響

腎臟肥大是糖尿病腎病早期的重要病理特征。由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠的腎臟肥大指數(shù)升高了89.84%(P＜0.01)。經(jīng)灌胃海參蟲(chóng)草復(fù)劑后，各組大鼠腎肥大指數(shù)均顯著下降，平均較模型對(duì)照組下降了21.25%(P＜0.05)，說(shuō)明海參蟲(chóng)草復(fù)劑可顯著抑制高血糖引起的腎臟肥大。

2.2 對(duì)尿中總蛋白、微量白蛋白(mAlb)含量的影響

尿蛋白及mAlb檢測(cè)為早期糖尿病腎病的臨床診斷指標(biāo)。由表1可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的尿總蛋白和mAlb排泄率分別提高了236.25%和135.14%(P＜0.01)。與模型對(duì)照組相比，低、高海參蟲(chóng)草復(fù)劑均能顯著降低模型大鼠的尿總蛋白和mAlb排泄率(P＜0.05，P＜0.01)，平均降低了32.30%和38.51%。

表1 海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)大鼠腎臟指數(shù)、尿蛋白和mAlb的影響(n=10，±s)Table 1 Effects of AC on kidney index，protein，and mAlb in diabetic rats(n=10，±s)

表1 海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)大鼠腎臟指數(shù)、尿蛋白和mAlb的影響(n=10，±s)Table 1 Effects of AC on kidney index，protein，and mAlb in diabetic rats(n=10，±s)

注:#P＜0.01與正常對(duì)照組相比較;*P＜0.05，＊＊P＜0.01與模型對(duì)照組相比較;圖1同。

組別 腎臟指數(shù)(g/kg)總蛋白(mg/24h)白蛋白(mg/24h)＊＊3.84±0.50 10.40±2.75 0.37±0.05模型對(duì)照組 7.29±0.67# 34.97±9.15# 0.87±0.05#復(fù)劑低劑量組Ⅰ 6.51±0.42* 28.70±5.30* 0.63±0.18*復(fù)劑高劑量組 4.99±0.57＊＊18.65±4.13＊＊0.44±0.09正常對(duì)照組

2.3 尿液中NAG排泄率的影響

NAG是一種溶酶體水解酶，主要存在于近端腎小管細(xì)胞的溶酶體中，尿液中NAG活性增高可作為腎小管細(xì)胞損傷的早期標(biāo)志物［9］。由圖1可見(jiàn)，模型對(duì)照組大鼠NAG排泄率較正常對(duì)照組提高了2.9倍(P＜0.01)，經(jīng)灌胃樣品后，各組大鼠NAG排泄率均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，分別較模型對(duì)照組降低了33.89%、46.61%。

2.4 腎皮質(zhì)的顯微觀察

在光鏡下可見(jiàn)，正常對(duì)照組大鼠的腎小球體積正常，毛細(xì)血管袢開(kāi)放，系膜細(xì)胞無(wú)增生，腎小管結(jié)構(gòu)正常(見(jiàn)圖2－A)。模型對(duì)照組大鼠腎小球體積增大，系膜區(qū)明顯擴(kuò)增，系膜細(xì)胞增生，GBM增厚明顯，腎小管出現(xiàn)明顯腫脹(見(jiàn)圖2－B)。灌胃海參蟲(chóng)草復(fù)劑8周后，大鼠腎小球病理癥狀得到明顯改善。其中，海參蟲(chóng)草復(fù)劑高劑量組腎小球體積基本恢復(fù)正常，毛細(xì)血管袢開(kāi)放，未見(jiàn)系膜細(xì)胞增生和GBM增厚，腎小管結(jié)構(gòu)趨于正常(見(jiàn)圖2－C)。表明海參蟲(chóng)草復(fù)劑能顯著改善糖尿病大鼠腎小球肥大及系膜細(xì)胞增生現(xiàn)象。

圖1 海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)模型大鼠NAG排泄率的影響(n=10，±s)Fig.1 Effects of AC on the excretion of NAG in diabetic rats(n=10，±s)

圖2 糖尿病大鼠腎皮質(zhì)顯微觀察HE染色(400×) Fig.2 HE stains of renal cortex in diabetic rats(400×)

2.5 腎皮質(zhì)的亞顯微觀察

2.5.1 腎小球 正常大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，濾過(guò)膜厚度均勻，三層細(xì)微結(jié)構(gòu)清晰(圖3－A，f、b、p所示)。足突分布均勻，無(wú)融合現(xiàn)象。模型對(duì)照組大鼠腎臟濾過(guò)膜節(jié)段性增厚，內(nèi)皮細(xì)胞三層細(xì)微結(jié)構(gòu)消失成勻質(zhì)狀(圖3－B)，足細(xì)胞突多呈連續(xù)性附著于基膜上，形成足突融合。系膜細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)胞核凋亡，染色質(zhì)凝結(jié)成塊，系膜區(qū)擴(kuò)大，系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)出現(xiàn)溶酶體大量聚集的情況(圖3－C，L所示)，表明模型對(duì)照組腎小球內(nèi)存在炎癥;經(jīng)海參蟲(chóng)草復(fù)劑干預(yù)后，均有所改善。其中，高復(fù)劑組效果最為突出，組成結(jié)構(gòu)接近正常大鼠(圖3－D)。表明海參蟲(chóng)草復(fù)劑可有效保護(hù)糖尿病大鼠腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)，從而改善腎小球的濾過(guò)功能。

2.5.2 腎小管 正常對(duì)照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，游離面具有刷狀緣，近曲小管近端刷狀緣涮狀緣整齊致密，遠(yuǎn)端稀疏(圖4－A，b所示)?；?jī)?nèi)陷成頂部小管和頂部小泡，襯在小管和小泡膜的內(nèi)面有一層中等電子密度的糖衣。這種結(jié)構(gòu)為近曲小管吸收蛋白的一種方式?；酌婵梢?jiàn)系膜內(nèi)褶系，褶間有許多縱行排列的桿狀線粒體，并可見(jiàn)少量溶酶體(圖4－A，L所示)。模型對(duì)照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞脫落、涮狀緣微絨毛減少變短、甚至脫落，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量溶酶體(圖4－B，L所示)及空泡，且伴有髓樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(圖4－C)。經(jīng)灌胃海參蟲(chóng)草復(fù)劑后，模型大鼠近曲小管近端結(jié)構(gòu)基本正常，刷狀緣微絨毛排列整齊致密，溶酶體數(shù)量較少(圖4－D)。表明海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)糖尿病大鼠腎小管具有保護(hù)作用。

圖3 糖尿病大鼠腎小球的透射電鏡觀察結(jié)果(10000×)Fig.3 Electron microscopy of glomerular in diabetic rats(10000×)

圖4 糖尿病大鼠腎小管的透射電鏡觀察結(jié)果(8000×)Fig.4 Electron microscopy of tubular in diabetic rats(8000×)

3 討論

NAG是一種重要的溶酶體水解酶，尿液中NAG主要來(lái)源于腎臟近曲小管上皮。當(dāng)?shù)鞍鬃阅I小球?yàn)V過(guò)增多時(shí)，在近曲小管重吸收，導(dǎo)致溶酶體酶激活，隨尿排出量增多。因此NAG可反映腎小管細(xì)胞的損害程度。孫建紅［10－11］等報(bào)道，蟲(chóng)草能有效的降低血清Cr、BUN水平，減輕內(nèi)生肌酐清除率的下降，降低尿中NAG和尿蛋白含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海參蟲(chóng)草復(fù)劑和蟲(chóng)草均能顯著降低DN大鼠mAlb與NAG排泄率。

DN的病理特點(diǎn)是腎臟肥大，腎小球?yàn)V過(guò)膜增厚和以腎小球系膜區(qū)為主的ECM積聚。ECM增加是糖尿病微血管病變的結(jié)構(gòu)標(biāo)志，腎內(nèi)ECM的積聚及血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是出現(xiàn)蛋白尿、腎功能下降等DN臨床表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［12］。ECM增多與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。許多研究證實(shí)，細(xì)胞增生出現(xiàn)于ECM蓄積之前，并持續(xù)存在于ECM蓄積及腎小球硬化發(fā)展過(guò)程中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海參蟲(chóng)草復(fù)劑能顯著抑制糖尿病大鼠ECM的積累和濾過(guò)膜變厚，減輕系膜細(xì)胞的增生，防止腎小球肥大。提示海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)腎小球的結(jié)構(gòu)和功能具有顯著的保護(hù)作用。

腎小管的主要功能是進(jìn)行重吸收。DN患者因腎小球病變，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)膜的通透性增強(qiáng)，濾過(guò)液中出現(xiàn)蛋白質(zhì)，從而激活了近曲小管內(nèi)的溶酶體，繼而造成腎小管損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海參蟲(chóng)草復(fù)劑能顯著降低腎小管內(nèi)溶酶體數(shù)量，減輕腎小管的腫脹程度，保護(hù)腎小管刷狀緣結(jié)構(gòu)。提示海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)腎小管的結(jié)構(gòu)和功能具有顯著地的保護(hù)作用。尿液生化分析表明，海參蟲(chóng)草復(fù)劑能顯著降低糖尿病大鼠尿蛋白、白蛋白和NAG水平，該結(jié)果進(jìn)一步從功能上證明了海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用。

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The protection mechanism of the mixture of Apostichopus japonicus and Cordyceps militaris in kidney of diabetic rats

YANG Yan－cun，WANG Jing－feng，LI Xiao－lin，ZHANG Xun，YANG Yu－h(huán)ong，XUE Chang－h(huán)u*
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

Objective:To study the protection mechanism of the mixture of Apostichopus japonicus and Cordyceps militaris(AC)in kidney of diabetic rats which were induced by Streptozotocin(STZ).Methods:Rats diabetic model，in which the kidneys were damaged under long－term high levels of blood glucose，was induced by one－time intraperitoneal injection of Streptozotocin(60mg/kg).The diabetic rats were given different dosage of the mixture of Apostichopus japonicus and Cordyceps militaris 300mg/kg·bw and 1200mg/kg·bw，8 weeks later，each of the following indicators were inspected:the renal index，the excretion of protein，Microalbuminuria(mAlb)，N－acetyl－β－D－Glucosaminidase(NAG)in urine and the morphologic change in kidney with electron microscopy and transmission electron microscopy.Conclusion:The mixture of Apostichopus japonicus and Cordyceps militaris decrease the renal index，mAlb，NAG，and amounts of lysosome in renal tubules.The AC also suppressed turgidity of renal tubules and protects structure of kidney.The mixture had remarkable function of protection in kidney of diabetic rats.

Apostichopus japonicus;Cordyceps militaris;diabetes nephropathy;glomerular basal membrane

TS201.4

A

1002－0306(2012)02－0396－04

2011－01－10 *通訊聯(lián)系人

楊延存(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:功能性食品。

海洋功能食品功效因子高效制備技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化示范(201105029);海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)和水環(huán)境污染、水產(chǎn)食品安全及廢棄物綜合利用技術(shù)研究(010DFA31330);國(guó)際科技合作項(xiàng)目。