楊海濤

Chelex－100法提取真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3－HERG的應(yīng)用體會(huì)

楊海濤

目的 探討Chelex－100法提取先天性長(zhǎng)QT綜合征相關(guān)人類(lèi)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3－HERG的可行性。方法 分別用Chelex－100法和堿裂解法提取pcDNA3－HERG質(zhì)粒，將環(huán)狀質(zhì)性DNA酶切為線性，0.8%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢測(cè)質(zhì)粒提取的有效性。結(jié)果 用Chelex－100法和堿裂解法提取的pcDNA3－HERG質(zhì)粒的OD(A260/A280)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［分別為(1.8±0.6)，(1.9±0.4)，P＞0.05］，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下檢測(cè)均有特定的清晰條帶。結(jié)論 兩種方法均能提取純度較高的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，Chelex－100法簡(jiǎn)便、省時(shí)，值得推廣。

pcDNA3－HERG; 真核表達(dá)質(zhì)粒質(zhì)粒;Chelex－100法;SDS－堿裂解法

先天性長(zhǎng)QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是由于編碼心肌離子通道蛋白的基因突變導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜離子通道功能障礙而引起的一組臨床綜合征。目前已發(fā)現(xiàn)了10個(gè)LQTS的相關(guān)基因，其中HERG基因突變引起編碼心臟延遲整流鉀電流功能障礙的長(zhǎng)QT綜合征在中國(guó)較為常見(jiàn)。人類(lèi)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3－HERG是研究該蛋白功能的有效工具。經(jīng)典的堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，適合于所有生物檢材，且提取的質(zhì)粒純度高，但操作繁瑣、復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，本文旨在探討一種新的操作步驟簡(jiǎn)單、省時(shí)提取質(zhì)粒的方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 大腸桿菌質(zhì)粒來(lái)源 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a:北京天為時(shí)代生物公司。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒pcDNA3－HERG:美國(guó)Wisconsin大學(xué)Anson BD博士惠贈(zèng)，Chelex－100(Bio－Rad)，DL2000marker (北京天為時(shí)代生物公司)，堿裂解法質(zhì)粒小量制備試劑盒DP2602(北京百泰克)，固體培養(yǎng)基，限制性?xún)?nèi)切酶 BamHI (購(gòu)自Promega公司)，50×TAE，溴化乙錠(EB)，0.8%瓊脂糖凝膠，其余試劑均為進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)。

1.3 主要設(shè)備 小型DNA電泳儀及電泳槽(日本產(chǎn))、低溫離心機(jī)(Backman)、電磁爐(上海產(chǎn))，WP型紫外透射反射分析儀(上海醫(yī)療器械廠)、可見(jiàn)分光光度機(jī)(日本島津，UV－2401PC型)、全自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)(法國(guó)VL)、電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠)。

1.4 大腸桿菌的培養(yǎng) 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于2.0 ml LB(含氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，37℃、250 g振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(約12～14 h)。

1.5 SDS－堿裂解法提取質(zhì)粒pcDNA3－HERG 于1.5 mlEp管中加入1.5 ml大腸桿菌液，按照堿裂解法質(zhì)粒小量制備試劑盒DP2602說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最終用70 μl EB洗脫緩沖液將大腸桿菌質(zhì)粒DNA洗脫保存。

1.6 Chelex－100提取質(zhì)粒pcDNA3－HERG 于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大腸桿菌液輕輕振蕩5 min，以求充分混勻，12 000 r/min離心2 min，去上清液，加200 μl 5%Chelex－100，56℃保溫30 min，劇烈振蕩5 s，沸水煮8 min，1000 r/min離心3 min，上清液即含用于酶切的質(zhì)粒DNA樣品。

1.7 質(zhì)粒DNA定量 在微量紫外分光光度計(jì)上分別測(cè)兩種不同方法提取質(zhì)粒DNA的吸光度(A，曾稱(chēng)光密度OD)值。

1.8 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 將獲得的環(huán)狀質(zhì)粒用BamHI酶切為線性，反應(yīng)體系如表1，快速混勻后，置37℃水浴1.5 h后，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 酶切反應(yīng)體系(μl)

2 結(jié)果

2.1 同體積大腸桿菌液提取的質(zhì)粒 DNA獲得量(A260/ A280)分別為(1.8±0.6)、(1.9±0.4)，兩種方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 用兩種方法提取的質(zhì)粒DNA片段均為9.3 kp，且條帶清晰可見(jiàn)(圖1)。

3 討論

圖1 兩種方法提取的質(zhì)粒DNA電泳鑒定結(jié)果

質(zhì)粒pcDNA3－HERG和細(xì)胞內(nèi)DNA不同的是質(zhì)粒呈環(huán)狀，作為表達(dá)載體有其特有cDNA啟動(dòng)子等其表達(dá)所需要的上游調(diào)節(jié)片斷。但其實(shí)質(zhì)仍然是DNA，因此，筆者嘗試用提取DNA的方法來(lái)提取質(zhì)粒pcDNA3－HERG。

本文用經(jīng)典的堿裂解法和Chelex－100法分別提取質(zhì)粒pcDNA3－HERG，然后把環(huán)狀的質(zhì)粒酶切成單鏈DNA，進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，在瓊脂糖電泳上都出現(xiàn)了特定區(qū)帶，而且Chelex100法也可成功提取純度較高的質(zhì)粒 pcDNA3－HERG。

經(jīng)典的堿裂解法的基本原理為:當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中，蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)，這是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，適合于所有生物檢材，且提取的質(zhì)粒純度高，但操作繁瑣、復(fù)雜、費(fèi)時(shí)［1］。

Chelex－100是一種螯合型離子交換樹(shù)脂，由苯乙烯和苯乙二烯組成的聚合物，Chelex懸液在100℃煮沸時(shí)可使蛋白質(zhì)變性，大腸桿菌細(xì)胞壁破裂，質(zhì)粒從細(xì)胞中釋放［2］。Chelex與二價(jià)金屬離子螯合，從而避免樣品中存在的金屬離子在高溫和低離子強(qiáng)度溶液中作為催化劑使DNA降解，Chelex還能夠抑制核酸酶對(duì)DNA的消化作用，并在高溫、低離子強(qiáng)度條件下催化DNA的釋放。它已廣泛應(yīng)用于微量血液、組織塊、精斑、骨骼及牙齒等法醫(yī)物證檢材［3］，這樣的處理過(guò)程既達(dá)到了分離提取DNA的目的，同時(shí)除去了一些影響酶切反應(yīng)以及免疫化學(xué)反應(yīng)的因子(如重金屬離子)，提高了質(zhì)粒pcDNA3－HERG在細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的利用率。該方法簡(jiǎn)便快速，無(wú)腐蝕，提取過(guò)程始終在同一試管中進(jìn)行，可減少DNA的損失，由于操作步驟簡(jiǎn)單，減少了污染機(jī)會(huì)。Sepp等［4］研究認(rèn)為，由于高溫對(duì)DNA有一定程度的降解作用，使得Chelex－100法提取的DNA片段在1000 bp以下，但是筆者的結(jié)果說(shuō)明該方法可以成功提出大于1000 bp的質(zhì)粒。

［1］Sambrook J，F(xiàn)rist sch EF，Maniatist，et al．Molecular cloning－a laboratory manual［J］.2nd．Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989: 119－122．

［2］Stein A，Raoult D．A simple method for amplification of DNA from paraffin－embedded tissues［J］．Nucleic Acids Res，1992，20:5237．

［3］Walsh PS，Metzger DA，Higuchi R．Chelex－100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR－based typing from forensic material［J］．Biotechniques，1991，10(4):506－513．

［4］Sepp R，Szabo I，Uda H，et al．Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR［J］．J Clin Pathol，1994，47:318－323．

10.3969/j．issn.1674－4985.2012.06.093

450003河南省人民醫(yī)院

楊海濤

2011－12－19)

(本文編輯:連勝利)