翟曉紅,陳振明

(杭州師范大學生物催化研究室，浙江 杭州 311121)

環(huán)己酮單加氧酶的克隆表達及酶學性質(zhì)分析

翟曉紅,陳振明

(杭州師范大學生物催化研究室，浙江 杭州 311121)

為研究鞘氨醇桿菌中環(huán)己酮單加氧酶的催化特性，從N.aromaticivoransDSM 12444基因組DNA克隆表達了一個編碼環(huán)己酮單加氧酶的基因chmo，并分析了該基因產(chǎn)物的酶學性質(zhì).該基因全長1650bp，編碼550個氨基酸，理論分子量為61.6 kDa.將攜帶此基因的重組質(zhì)粒 pET28a-chmo轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)后，獲得了62 kDa 左右的表達產(chǎn)物.重組環(huán)己酮單加氧酶(CHMO)能氧化芳香族硫醚及其衍生物、鏈式硫醚、其他硫醚和酮類等底物，以2-氯乙基苯基硫醚為底物時活力最高(25.65 U/mg).CHMO最適反應(yīng)溫度和 pH分別為55 ℃和 8.87，傾向于利用 NADPH作輔酶.上述結(jié)果表明，重組CHMO是一個新型的環(huán)己酮單加氧酶，推測其與硫醚及酮類物質(zhì)的氧化降解有關(guān).

環(huán)己酮單加氧酶；鞘氨醇桿菌；優(yōu)化表達；酶學性質(zhì)

Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMOs)家族屬于黃素類單加氧酶，通常用來立體選擇性氧化鏈狀和環(huán)狀的酮，生成相應(yīng)的酯或內(nèi)酯，也能催化硫、氮和磷的親電氧化反應(yīng), 同時BVMOs還能催化酮和硼的親核氧化反應(yīng)[1].環(huán)己酮單加氧酶不僅可以提供極有價值的手性砌塊，而且在手性藥物的合成方面也具有很大的應(yīng)用潛力.如它可以將極為廉價的非手性藥物中間體雙環(huán)[3,2,0]-2-雙鍵-6-酮，加氧轉(zhuǎn)化為極為昂貴的手性酯，生成物與反應(yīng)物的市場價格相差近1000倍[2].它還可以催化含硫原子的手性前體生成光學活性的手性藥物如莫達非尼和質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑等[3-4].不是所有該家族的酶都能夠外源表達[5]，自20世紀80年代第一個BVMO家族的環(huán)己酮單加氧酶(CHMOAci)的基因被克隆[6]至今，通過Genome-mining 等方法已經(jīng)獲得20余種該類酶.已有幾種 CHMOs 得到了商業(yè)利用,但是還存在不足:產(chǎn)量很低,酶不穩(wěn)定等很多問題[7].更多有價值的BVMO和基因工程菌尚有待發(fā)現(xiàn).

為了獲得高活力的BVMO，該研究從鞘氨醇桿菌N.aromaticivoransDSM 12444基因組中擴增出環(huán)己酮單加氧酶基因chmo，在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了功能性表達，對其酶學性質(zhì)進行了研究，并探討了重組CHMO在硫氧化反應(yīng)合成手性亞砜方面的應(yīng)用潛力.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

N.aromaticivoransDSM 12444購自JCM，質(zhì)粒pET-28a實驗室保藏.

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，Phusion DNA聚合酶購自Finnzymes公司，質(zhì)粒純化試劑盒、核酸純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自Promega，基因組提取試劑盒購自天根.

PCR儀(美國ABI，veriti)，凝膠成像儀(Biorad-jeldoc)，蛋白電泳儀(天能，VE-180)，恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海精宏，HZP-150)；超凈工作臺(蘇凈安泰，SW-CJ-2FD).

1.1.3 培養(yǎng)基

PYG培養(yǎng)基(g/L)-蛋白胨：10.0，酵母提取物：5.0，葡萄糖：1.0，pH6.8-7.0,121 ℃高壓滅菌20 min.LB培養(yǎng)基(g/L)-蛋白胨：10.0，酵母提取物：5.0，NaCl：10.0，pH7.0, 121 ℃高壓滅菌20 min.

1.2 CHMO基因的克隆和表達

1.2.1 鞘氨醇桿菌(N. aromaticivorans DSM 12444)的培養(yǎng)

菌體接入滅過菌的PYG培養(yǎng)基，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng).

1.2.2 基因組DNA的提取

參照細菌基因組提取試劑盒(天根).

1.2.3 CHMO基因的PCR擴增條件

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫注冊的環(huán)己酮單加氧酶基因序列設(shè)計引物，以N.aromaticivorans基因組DNA為模板擴增環(huán)己酮單加氧酶CHMO(YP_496757)基因.引物如下，PF：(CATATGGAAGCAGCAGCCGGT)，PR：(CTCGAGTCAGGCCATTTCGAAGCCTTCGT).98 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，63.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，然后加Taq 72 ℃延伸20 min，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.4 TA克隆

CHMO基因的純化參照Promega瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒相關(guān)操作，純化后CHMO基因構(gòu)建至pGEM-T Easy，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性克隆.

陽性克隆參照Promega質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，PCR驗證.南京金斯瑞公司測序.

1.2.5 表達載體構(gòu)建

雙酶切測序正確的pGEM-T-chmo，分離回收后的目的基因構(gòu)建至pET-28a(+)，獲得pET-28a(+)-chmo表達載體，將此表達載體轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，卡那霉素抗性篩選陽性克隆，獲得目的基因工程菌.

1.2.6 目的蛋白表達、誘導條件優(yōu)化

將工程菌接于5 mL LB(含50 μg/mL Kan)中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜然后將菌液按1∶100比例轉(zhuǎn)接于裝有100 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)三角瓶中，繼續(xù)進行菌體培養(yǎng)，當OD600nm 到0.6～0.8時，加入0.1 mmol/L IPTG，18 ℃、150 rpm振蕩培養(yǎng)18 h，離心收菌， SDS-PAGE(濃縮膠5%，分離膠12%)分析目標產(chǎn)物表達情況.

進一步表達條件優(yōu)化以O(shè)D600nm約為0.6～0.8時，不同溫度(15 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃)、不同搖床轉(zhuǎn)速(110 r/min、150 r/min、170 r/min、200 r/min)及向培養(yǎng)物中加入不同終濃度的IPTG，進行誘導培養(yǎng)，通過SDS-PAGE分析考察誘導培養(yǎng)條件對目的基因表達的影響.

1.3 CHMO的酶學性質(zhì)及同源建模

1.3.1 CHMO蛋白純化及酶活力

采用Ni+柱親和層析一步法純化蛋白CHMO，操作步驟參照 Ni SepharoseTM6 Fast Flow試劑盒的使用指南.

還原型輔酶NADPH在340 nm處有明顯吸收，而氧化型NADP+無吸收.CHMO在氧化硫化物生成光學亞砜的過程中會消耗NADPH生成NADP+，引起吸光值降低.酶活力測定體系為：Tris-HCl(50 mM，pH 8.87) 2.86 mL；NADPH 0.40 μmol；茴香硫醚0.6 μmol；蛋白0.4 mg.酶活力單位定義為：在室溫25 ℃下，每分鐘消耗1 μmol NADPH的酶量定義為1個酶活力單位(U).

1.3.2 CHMO輔酶依賴性

分光光度法檢測相同條件下CHMO以NADH和NADPH分別作輔酶時的活性，判斷輔酶依賴型.

1.3.3 溫度和pH對CHMO酶活力的影響

測定不同溫度(25 ℃～75 ℃)下酶催化氧化茴香硫醚的活力以確定最適溫度.

采用50 mM Tris-HCl(pH 7.42～8.87)和50 mM 甘氨酸-NaOH(pH 8.87～9.65)，檢測不同pH值對硫氧化酶氧化茴香硫醚活力的影響，確定最適pH.

每組設(shè)3組平行實驗.

1.3.4 CHMO的底物特異性

測定純化后的CHMO對20種不同底物(見表1)的反應(yīng)活性，確定CHMO的底物廣譜性.

1.3.5 三維結(jié)構(gòu)分析及蛋白的同源建模

搜索瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的Swiss pro Modeling 建模服務(wù)器,通過提交的序列信息在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫中搜尋模板,在Swiss-pdb viewer 中通過人工方法對局部結(jié)構(gòu)進行調(diào)整,采用蛋白質(zhì)三維圖像軟件Swiss-Pdb Viewer 打開并分析作圖.

表1 CHMO的底物特異性Tab. 1 The substrate specificity of CHMO

2 結(jié)果與分析

2.1 CHMO基因的克隆

以抽提的N.aromaticivoransDSM 12444基因組為模板，利用引物PF和PR進行PCR，擴增出環(huán)己酮單加氧酶編碼基因chmo，經(jīng)測序該基因長為1650 bp(見圖1)，編碼550個氨基酸，理論計算分子量為61.6 kDa.

2.2 表達載體pET-28a(+)-chmo的構(gòu)建

獲得環(huán)己酮單加氧酶基因后，將其連接到pGEM-T Easy上，得到pGEM-T-chmo重組質(zhì)粒送去測序，將測序正確的環(huán)己酮單加氧酶基因連接到pET-28a(+)(NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切)上，得到pET-28a(+)-chmo重組質(zhì)粒. 以上述兩個限制性內(nèi)切酶雙酶切重組質(zhì)粒，得到大小為1600 kb左右的片段(見圖2)，證明環(huán)己酮單加氧酶基因已插入到pET-28a(+)載體中，成功構(gòu)建了pET-28a(+)-chmo表達載體.將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-chmo轉(zhuǎn)入到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，得到重組菌.

圖1 PCR 產(chǎn)物Fig. 1 Production of PCR

圖2 pET-28a-chmo雙酶切結(jié)果Fig. 2 Plasmid digested of PCR by NdeⅠand XhoⅠ

M: marker; 1:誘導后全菌液；2：破碎后上清；3：Ni柱純化后蛋白圖3 表達產(chǎn)物及純化后SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the soluble proteins and purified enzyme

2.3 重組CHMO的表達與純化

通過IPTG濃度、溫度、搖床轉(zhuǎn)速等產(chǎn)酶因素優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)條件為：37 ℃培養(yǎng)至 OD600為0.6～0.8時，添加0.4 mmol/L IPTG，15 ℃，110 rpm誘導 14 h.對重組菌進行超聲波破碎并離心分離，Ni柱純化.重組酶純化后的比活力為3.75 U/mg(為純化前的1.17倍)， 蛋白大部分出現(xiàn)在上清液中，表明經(jīng)過表達條件優(yōu)化該重組酶在水溶液中具有較好的溶解度.重組蛋白大小在60 KDa左右，符合預(yù)期.

利用重組質(zhì)粒攜帶的組氨酸標簽，表達的重組酶經(jīng)Ni2+親和色譜純化后SDS-PAGE 檢測，顯示為單一條帶(圖 3)，實現(xiàn)了重組蛋白的一步純化.

2.4 酶學性質(zhì)檢測結(jié)果

2.4.1 CHMO輔酶依賴性

用NADPH作輔因子測定CHMO的比活力為3.75 U/mg，是用NADH作輔因子時的4倍左右，所以CHMO更傾向于用NADPH作輔因子.

2.4.2 溫度和pH對CHMO酶活力的影響

測定不同溫度下重組 CHMO的酶反應(yīng)初速度，研究溫度對酶活力的影響.結(jié)果如圖 4a 所示，當氧化茴香硫醚(PMS)時，酶活力在55 ℃達到最大值，然后隨著溫度的升高而降低.高溫對重組酶的活力影響很明顯，65 ℃時相對酶活力僅有57%.

圖4a 溫度對CHMO催化活性的影響Fig.4a Effect of temperature on activity of CHMO

圖4b pH對CHMO催化活性的影響Fig.4b Effect of pH on activity of CHMO

在最適溫度下，采用不同pH值的緩沖體系，分別測定酶反應(yīng)初速度，確定重組CHMO的最適pH值.當以PMS為底物時， pH值為8.87時酶活力最大， pH適應(yīng)范圍較窄(圖 4b).

2.4.3 CHMO的底物特異性

選PMS作為標準底物，活力為(3.75 U/mg)，測定其他20種底物的相對活性(表 1).由表中數(shù)據(jù)可知，CHMO幾乎對所有的芳香族硫醚及其衍生物都具有較高的活性，但是對直鏈的硫醚活性普遍較低，對甲基硫環(huán)己酯和1,3,-二噻烷的活性也很高，可以考慮作為催化合成各種手性亞砜的催化劑.

2.5 同源建模

Blast分析表明CHMO的基因與醋酸鈣不動桿菌的環(huán)己酮單加氧酶(GenBank Accession No. BAA86293.1)具有同源性，氨基酸相似性為41.3%.預(yù)測該片段的氨基酸序列,并進行氨基酸同源性對比時發(fā)現(xiàn)該片段與單加氧酶家族諸多成員具有較高的同源性,并且包含兩個“GXGXXG”序列(可成為FAD和BVMO的非共價結(jié)合位點)和一個BVMO家族的特征性指紋“F(Y)XGXXXHXXXW”[8].第一個氨基酸發(fā)生了變異但是仍然同屬于芳香族氨基酸，仍然可以判定CHMO為BVMO家族[9].通過SWISS-MODEL同源建模服務(wù)器對其進行3D結(jié)構(gòu)模擬分析，發(fā)現(xiàn)該酶具有經(jīng)典的BVMO三維結(jié)構(gòu)和FAD的結(jié)合域(圖5).

圖5 重組環(huán)己酮單加氧酶的3D結(jié)構(gòu)模擬Fig. 5 Structural modelling of recombinant CHMO from N. aromaticivorans

3 討 論

鞘氨醇桿菌中含有8個BVMO編碼基因，是篩選和研究BVMO的一個良好酶源[5].通過基因克隆在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達，并利用His-tag作為純化標簽純化重組酶，是一個較為高效的研究BVMO的策略.但是外源表達時重組蛋白常以包涵體形式存在，根據(jù)文獻[10]外源基因以包涵體形式表達是因為外源基因在大腸桿菌中表達過快，沒有得到正確折疊，其能否以可溶形式表達不僅取決于基因、載體和宿主三者之間的相互關(guān)系，而且受到誘導物的濃度、誘導溫度等條件的影響.本文中通過優(yōu)化CHMO的誘導表達條件在低溫(15 ℃)誘導下獲得了CHMO的可溶性高效外源表達.

本實驗中，將攜帶CHMO基因的重組質(zhì)粒 pET28a-chmo轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)后，獲得了62 kDa 左右的表達產(chǎn)物，與預(yù)期相符.使用Ni柱純化后測定其最適反應(yīng)溫度為55 ℃與熱穩(wěn)定的PAMO[11]相似.與其他BVMO[12]不同的是CHMO對酮類底物活性普遍偏低對硫化物的活性較高，尤其是以2-氯乙基苯基硫醚為底物時活力最高(25.65 U/mg).重組CHMO作為一種新型的生物催化劑，推測其主要與硫化物的代謝有關(guān).

隨著手性化學合成中手性砌塊需求的不斷增加，“環(huán)境友好、能耗低、排放少”的手性生物合成技術(shù)中的生物催化劑——酶的研究開發(fā)顯得越來越重要[13-16]，一方面是尋找新的酶種，另一方面對已有酶進行分子改造，提高其性能.通過實驗測定了CHMO的一些酶學基本性質(zhì)，為進一步探索CHMO的熱穩(wěn)定性、離子濃度和有機試劑對酶活性的影響及對酶的對映體選擇性的影響以及結(jié)構(gòu)改造等打下基礎(chǔ)，相關(guān)研究工作正在進行中.

[1] Zambianchi F, Pasta P, Garrea G,etal. Use of isolated cyclohexanone monooxygenase from recombinantEscherichiacolias a biocatalyst for Baeyer-Villiger and sulfide oxidations [J]. Biotechnology and Bioengineering,2002,78(5)：389-496.

[2] 李華,邵宗澤.一株太平洋深海環(huán)己酮降解菌的篩選與功能研究[J].微生物學報，2007,47(5):828-833.

[3] Alphand V, Wohlgemuth R. Applications of Baeyer-Villiger monooxygenases in organic synthesis[J]. Current Organic Chemistry,2010,14:1928-1965.

[4] 姜標,黃浩，羅軍,等.硫化物的生物氧化成手性亞砜[J].有機化學,2005,25(12):1542-1547.

[5] Pazmino, D E T, Fraaije M W. Discovery, redesign and applications of Baeyer-Villiger monooxygenases [M]. The Netherlands: T. Matsuda,2007:107-127.

[6] Chen Y C, People O P, Walsh C T.AcinetobacterCyclohexanone Monooxygenase: Gene Cloning and Sequence Determination [J]. Journal of Bacteriology,1988,170(2):781-789.

[7] Kirschner A， Bornscheuer U T. Baeyer-Villiger Monooxygenases in Organic Synthesis [M]. Germany : John Wiley & Sons, Inc,2009:115-149.

[8] Fraaije M W, Kamerbeek N M, Berkel W J H van,etal. Identification of a Baeyer-Villiger monooxygenase sequence motif [J]. FEBS Lett,2002,518:43-47.

[9] Mirza, I A, Yanchain B J, Wang Shaozhao,etal. Crystal Structures of Cyclohexanone Monooxygenase Reveal Complex Domain Movements and a Sliding Cofactor [J]. J Am Chem Soc,2009,131:8848-8854.

[10] Surinder M S, Amulya K P. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins [J]. J Biosci & Bioeng,2005,99(4):303-310.

[11] Fraaije, M W, Wu Jin, Heuts DPHM,etal. Discovery of a thermostable Baeyer-Villiger monooxygenase by genome mining [J]. Appl Microbiol Biotechnol,2005,66:393-400.

[12] Holland, H L. Biotransformation of organic sulfides[J]. Nat Prod Rep,2001,18:171-181.

[13] 劉慶彬.酶催化工藝用于制藥工業(yè)的研究進展[J].化工進展,2004,23(6):590-594.

[14] 呂彤,劉揚，趙青,等.烯酮還原酶基因的克隆與優(yōu)化表達[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學報,2011,17(1):87-90.

[15] Ran Ningqing., Zhao Lishan, Chen Zhenming,etal. Recent applications of biocatalysis in developing green chemistry for chemical synthesis at the industrial scale [J]. Green Chem,2007,10(4):361-372.

[16] 盧小春，賴敦岳，裴曾飛，等.α-苯乙醇的酶法拆分工藝優(yōu)化[J].杭州師范大學學報：自然科學版，2010,9(4)：252-256.

CloningExpressionandEnzymeCharacterizationofaCyclohexanoneMonooxygenase

ZHAI Xiao-hong, CHEN Zhen-ming

(Lab of Biocatalysis, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311121, China)

To explore the biocatalytic properties of cyclohexanone monooxygenase(CHMO) inN.aromaticivorans, the experiment cloned the genechmofromN.aromaticivoransDSM 12444, and analyzed the enzyme characterization of its products. The length of the genechmowas 1650bp encoding a CHMO with 550 amino acid residues and calculated molecular mass of 61.6 kDa. The recombinant plasmid pET-28a-chmowas constructed and functionally expressed inE.coliBL21 (DE3), resulting in the products with the size of 62 kDa. The recombinant CHMO could oxidize aromatic sulfide and its derivatives, chain sulfide as well as other sulfide and ketone substrates. The enzyme showed the highest activity against 2-chloro ethyl phenyl sulfide, withVmaxof 25.65 U/mg. The optimal temperature was 55 °C and optimal pH was 8.87, NADPH was inclined to be the coenzyme. These results indicate that the recombinant CHMO was a novel CHMO and might play a role in the oxidative degradation of sulfide and ketones.

cyclohexanone monooxygenase;N.aromaticivorans; optimized expression; enzyme characterization

2012-04-03

陳振明(1971—)，男，副教授，主要從事生物催化和綠色化學研究.E-mail： zmchen05@gmail.com

11.3969/j.issn.1674-232X.2012.05.003

Q814.9

A

1674-232X(2012)05-0397-06