陳立思， 聞?wù)嬲? 蔡繼業(yè), 曾偉達(dá)， 劉運(yùn)權(quán), 王 曼， 劉 偉*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642； 2.廣州花卉研究中心，廣東廣州 510360)

4種兜蘭RubisCO的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)初步研究

陳立思1，2， 聞?wù)嬲?, 蔡繼業(yè)1, 曾偉達(dá)2， 劉運(yùn)權(quán)1, 王 曼1， 劉 偉1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642； 2.廣州花卉研究中心，廣東廣州 510360)

采用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析與凝膠過(guò)濾層析的方法，分離純化得到硬葉(Paphiopedilummicranthum)、紫紋(P.purpurattum)、帶葉(P.hirsutissimum)和亨利(P.henryanum)4種兜蘭RubisCO的大、小亞基，相對(duì)分子量分別為51.5×103～54.5×103和15.0×103～16.0×103. 4種兜蘭RubisCO的羧化/加氧活性在pH8.0、溫度30 ℃時(shí)最高，其活性大小順序?yàn)橛踩~兜蘭>紫紋兜蘭>亨利兜蘭>帶葉兜蘭，且紫紋兜蘭、亨利兜蘭的羧化/加氧活性比值相對(duì)高于硬葉兜蘭、帶葉兜蘭；硬葉兜蘭RubisCO的Km(RuBP)值最小.4種兜蘭RubisCO的特性反映了其不同的生理和生境特征.

兜蘭(Paphiopedilum); RubisCO; 分離純化; 酶學(xué)性質(zhì)

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶( E.C.4.1.1.39)(簡(jiǎn)稱RubisCO)存在于葉綠體基質(zhì)中，是所有光合生物進(jìn)行光合碳同化的關(guān)鍵性酶[1].目前，已經(jīng)從多種植物中分離純化了RubisCO，但有關(guān)兜蘭RubisCO的研究卻未見報(bào)道.兜蘭屬(Paphiopedilum)是蘭科(Orchidaceae)植物中最具特色的一個(gè)類群，得名于其呈兜狀的唇瓣，具有較高的觀賞和研究?jī)r(jià)值.由于野生兜蘭受到掠奪性采挖和貿(mào)易，導(dǎo)致數(shù)量急劇減少甚至滅絕.對(duì)野生兜蘭進(jìn)行有效保護(hù)是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，而對(duì)其光合作用關(guān)鍵酶RubisCO的研究可為研究其光合作用特性提供基礎(chǔ)，并能為其保護(hù)和栽培提供理論支持.

不同兜蘭對(duì)光照的要求不同，其光合作用特性也不同.本論文從硬葉、紫紋、帶葉和亨利4種兜蘭(Paphiopedilum)中分離純化RubisCO，并對(duì)該酶的部分特性進(jìn)行研究,為認(rèn)識(shí)兜蘭的光合作用特性，提高栽培效率提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料硬葉兜蘭(P.micranthum)、紫紋兜蘭(P.purpurattum)、帶葉兜蘭(P.hirsutissimum)和亨利兜蘭(P.henryanum)均為原生種，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化控研究室提供.栽培條件為濕度60%以上，溫室有風(fēng)機(jī)水簾降溫，棚頂覆蓋二層遮陽(yáng)網(wǎng).

1.2 RubisCO的分離純化

取生長(zhǎng)良好、濃綠色的兜蘭葉片，洗凈，晾干.稱取15～20 g，加入預(yù)冷的酶提取液(50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L MgCl2，0.5%的Gly，0.6% β-巰基乙醇，10 mmol/L的抗壞血酸，1% PVP，酶提取液的體積數(shù)/葉片質(zhì)量數(shù)=1/5)和少量石英砂，搗碎成勻漿，4層紗布過(guò)濾.得到的粗酶液經(jīng)飽和 (NH4)2SO4分段鹽析、Sephadex G-25換鹽、DEAE纖維素陰離子交換柱層析(0～4 ℃)、Sephadex G-200 凝膠過(guò)濾純化.

1.3 酶活性測(cè)定

RubisCO羧化活性的測(cè)定參照Racker的分光光度計(jì)法[2]，在最適的反應(yīng)條件下，每分鐘催化1 μmol CO2所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U). 加氧活性的測(cè)定方法為氧電極法[3].

1.4 蛋白純度檢測(cè)和分子量確定

參照趙永芳等介紹的方法[4]，采用不連續(xù)垂直板狀非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)檢測(cè)蛋白純度.利用SDS-PAGE測(cè)定亞基的分子量大小，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量(Protein low molecular marker，TAKARA)的對(duì)數(shù)和泳動(dòng)率呈線性關(guān)系而求出未知蛋白質(zhì)的分子量，其中泳動(dòng)率=(蛋白質(zhì)遷移的距離/染料移動(dòng)的距離)×(染色前凝膠的長(zhǎng)度/脫色后凝膠的長(zhǎng)度).

1.5 蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，用牛血清蛋白(BSA)做標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

1.6 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

RubisCO對(duì)底物二磷酸核酮糖(RuBP)的Km和Vmax測(cè)定方法采用雙倒數(shù)作圖法[4].

2 結(jié)果與分析

2.1 RubisCO的分離純化

粗酶液經(jīng)用體積分?jǐn)?shù)為30%～50%的硫酸銨分段鹽析-DEAE陰離子交換(0.3 mol/L NaCl洗脫)-Sephadex G-200凝膠過(guò)濾的流程純化后，得到了純度達(dá)到85%以上的RubisCO酶蛋白(圖1)，純化倍數(shù)均達(dá)到5倍以上(表1).

1：粗酶液；2：硫酸銨沉淀后酶液；3：陰離子交換后酶液；4：凝膠過(guò)濾后酶液

表1 4種兜蘭RubisCO的純化Table 1 Purification of RubisCO from 4 species of Paphiopedilum

2.2 RubisCO亞基分子量確定

SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明，4種兜蘭RubisCO的大、小亞基分別位于標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子量蛋白66.4×103～44.3×103之間和20.1×103～14.3×103之間(圖2A).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)與泳動(dòng)率之間的線性關(guān)系(圖2B)，計(jì)算出各種兜蘭RubisCO大、小亞基的相對(duì)分子量，范圍為51.5×103～54.5×103和15×103～16×103(圖2A)，與已報(bào)道的RubisCO的大、小亞基相對(duì)分子量范圍一致[5].

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

硬葉和紫紋2種斑葉類兜蘭RubisCO的羧化活性和加氧活性顯著高于帶葉和亨利2種綠葉兜蘭，亨利兜蘭和紫紋兜蘭的羧化/加氧值則顯著高于帶葉兜蘭和硬葉兜蘭(表2).

4種兜蘭RubisCO對(duì)底物RuBP羧化活性的分析結(jié)果見表2，硬葉兜蘭RubisCO的Km值最小，對(duì)底物RuBP的親和力最高，帶葉兜蘭RubisCO的Km值最大，對(duì)底物RuBP的親和力最低；紫紋兜蘭RubisCO的Vmax/Km值最大，說(shuō)明其對(duì)底物的專一性最強(qiáng).

圖2 RubisCO大、小亞基分子量的確定

2.4 酶穩(wěn)定性

在30 ℃時(shí)，4種兜蘭RubisCO羧化活性均最大，除帶葉兜蘭外，其它3種兜蘭的羧化活性在溫度小于25 ℃和大于30 ℃時(shí)下降明顯(圖3A)；在pH 8測(cè)得的羧化活性最大，在pH 6，幾乎檢測(cè)不到RubisCO的羧化活性，此時(shí)接近RubisCO等電點(diǎn)，RubisCO解離為大亞基核L8和游離小亞基[6]；在pH 3～5時(shí)，RubisCO羧化活性重新增加，其增幅小于pH 7～9的增幅值(圖3B).以上結(jié)果表明帶葉兜蘭RubisCO的熱穩(wěn)定性最強(qiáng)，另外3種兜蘭的熱穩(wěn)定性無(wú)明顯差異.而硬葉和紫紋兜蘭的活性受pH影響的程度大于亨利和帶葉兜蘭.

圖3 4種兜蘭RubisCO的溫度(A)和pH(B)穩(wěn)定性

3 討論

RubisCO是植物可溶蛋白中含量最高的蛋白，達(dá)到50%左右. SUREZ等[7]利用陰離子交換的方法從小麥中分離純化的RubisCO純度高于96%，回收率高于75%，目前缺乏兜蘭RubisCO分離純化的報(bào)道.本研究參照其它植物RubisCO的分離純化方法，針對(duì)兜蘭葉片多糖、酚類物質(zhì)含量高的特點(diǎn)，在提取液中加入PVP去除多糖；并利用陰離子交換和凝膠過(guò)濾的方法，從4種兜蘭中成功分離到了RubisCO.相比前述小麥RubisCO的分離純化，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，回收率較低(35%～42%)，但得到的RubisCO純度達(dá)85%以上，適用于酶學(xué)性質(zhì)的進(jìn)一步研究.

RubisCO具有雙重功能：在CO2分壓高時(shí), 使二磷酸核酮糖(RuBP)羧化, 產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA)，推動(dòng)C3 碳循環(huán)；在O2分壓高時(shí)，產(chǎn)生1分子的PGA和1分子的磷酸乙醇酸而引起C2氧化循環(huán)及光呼吸，即酶的氧化活性.在酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)上，Km(RuBP)和Vmax的大小可以反映RubisCO羧化/氧化能力的高低.4種兜蘭RubisCO對(duì)底物RuBP的Km值，大小依次為帶葉兜蘭(1.26 mmol/L)>亨利兜蘭(1.19 mmol/L)>紫紋兜蘭(0.94 mmol/L)>硬葉兜蘭(0.93 mmol/L)，4種兜蘭Km值之間沒有顯著性差異，但與陳根云[4]提供的參考值20～25 μmol/L相比，RubisCO對(duì)底物RuBP的Km值增加，說(shuō)明兜蘭RubisCO對(duì)底物RuBP的親和能力不高，與兜蘭屬植物光合速率低相符合[8].而斑葉類兜蘭紫紋和硬葉的Vmax值顯著高于綠葉類兜蘭帶葉和亨利，Vmax與CO2固定速率有關(guān)，說(shuō)明斑葉類兜蘭對(duì)CO2的固定速率高于綠葉類兜蘭.

與Km值對(duì)應(yīng)的4種兜蘭RubisCO的羧化/加氧活性比值依次為硬葉兜蘭>紫紋兜蘭>亨利兜蘭>帶葉兜蘭，結(jié)合其形態(tài)和生境特征，斑葉類兜蘭高于綠葉類兜蘭，斑葉類兜蘭生長(zhǎng)在堿性土中，Km高于酸性土中的綠葉類兜蘭.CO2濃度是RubisCO活性的關(guān)鍵限制因素[9]，紫紋兜蘭和亨利兜蘭的羧化/加氧值相對(duì)高于硬葉兜蘭和帶葉兜蘭，說(shuō)明二者在高濃度CO2的環(huán)境下能更好地進(jìn)行光合作用，這與前述2類兜蘭Vmax之間的差異一致.4種兜蘭RubisCO的羧化活性、羧化/加氧活性比都低于水稻和小麥等作物，陰生環(huán)境下的兜蘭的光合作用能力較低，可能與其對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)有關(guān).

植物RubisCO在體內(nèi)的最大活性溫度多為20～30 ℃，而在體外失活溫度為50 ℃以上[10].本研究中4種兜蘭的RubisCO在pH 8、葉溫30 ℃時(shí)羧化活性最大，對(duì)應(yīng)空氣溫度25 ℃，為其最適生長(zhǎng)溫度.在pH為3～5的時(shí)候，4種兜蘭RubisCO羧化活性重新回到一個(gè)小的高峰，此時(shí)對(duì)應(yīng)紫紋兜蘭最適生長(zhǎng)環(huán)境的pH值(4.1～5.1)[11]；帶葉兜蘭與紫紋兜蘭同屬酸性土壤類型，其RubisCO在pH 5時(shí)達(dá)到最大羧化活性.

以上研究說(shuō)明，4種兜蘭的RubisCO特性反映了其不同的生境和生理特征.兜蘭具有極高的觀賞價(jià)值，在栽培過(guò)程中缺乏生理特性研究，以致目前無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)；另一方面，市場(chǎng)的需求導(dǎo)致野生兜蘭資源的過(guò)度挖掘，廣東等野生兜蘭分布區(qū)中一些品種已經(jīng)瀕臨滅絕[12].因此，從生產(chǎn)和植物保護(hù)兩方面來(lái)說(shuō)，對(duì)兜蘭光合生理等特性的了解是為提高栽培技術(shù)和采取有效保護(hù)措施的理論前提，本研究對(duì)4種兜蘭RubisCO的研究將為進(jìn)一步了解各兜蘭的生理特征和光合特性，指導(dǎo)栽培管理提供理論基礎(chǔ).

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PrimaryStudyontheIsolationandEnzymaticPropertiesofRubisCOfromFourSpeciesofPaphiopedilum

CHEN Lisi1,2, WEN Zhenzhen1, CAI Jiye1, ZENG Weida2, LIU Yunquan1, WANG Man1, LIU Wei1*
(1.College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2. Guangzhou Flower Research Center, Guangzhou 510360, China)

RubisCOs were isolated and purified fromPaphiopedilummicranthum,P.purpurattum,P.hirsutissimumandP.henryanumby (NH4)2SO4precipitation, anion exchange and gel filtration chromatography in succession. The molecular weights of their large and small subunits were 51.5×103～54.5×103and 15.0×103～16.0×103, respectively. Their zymologic characters were further studied. The results showed that these four RubisCOs from differentPaphiopedilumhad the highest activity at pH 8.0 and 30 ℃, and the descending order of RuBPcase/oase activity wasP.micranthum,P.purpurattum,P.henryanumandP.hirsutissimum, and the RuBPcase/oase activity ratio ofP.purpurattumandP.henryanumwere higher than that ofP.micranthumandP.hirsutissimum. TheKm(RuBP) value ofP.Micranthum’sRubisCO is the lowest in the fourPaphiopedilumspecies, which indicated that its affinity to RuBP is the highest. The physiological and habitat characteristics of the four differentPaphiopedilumwere reflected by properties of RubisCOs isolated from them, which provided a basis for further investigation of their photosynthetic physiology.

2012-04-25

廣東省農(nóng)業(yè)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008-810)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008B02040006)

*通訊作者，liuwei@scau.edu.cn

1000-5463(2012)03-0112-04

Q55

A

10.6054/j.jscnun.2012.06.024

Keywords：Paphiopedilum; RubisCO; isolation; enzymatic properties

【責(zé)任編輯 成 文】