肖學(xué)成 陳鳳 李丹 李金

湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430065

HPLC法測(cè)定阿達(dá)帕林凝膠中藥物的體外透皮吸收量

肖學(xué)成 陳鳳 李丹 李金

湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 430065

目的建立阿達(dá)帕林凝膠體外透皮接收液中藥物的HPLC測(cè)定方法，研究阿達(dá)帕林凝膠體外透皮能力。方法采用Global C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇-水-四氫呋喃（86∶9∶5）（用三氟醋酸調(diào)節(jié)pH值到3.5）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。體外透皮實(shí)驗(yàn)采用改良的Franz擴(kuò)散池，以實(shí)驗(yàn)用離體乳豬皮為透皮屏障，自制凝膠與市售凝膠的透皮結(jié)果對(duì)比，分別在不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定透皮接收液中阿達(dá)帕林濃度，計(jì)算累積透皮量。結(jié)果阿達(dá)帕林的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=1.031 88C-0.042 7（r=0.999 9），線性范圍0.189～2.268μg/mL，平均回收率為99.93%。累積透皮吸收量與時(shí)間呈良好的線性關(guān)系，自制凝膠與市售凝膠的透皮結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，是考察阿達(dá)帕林凝膠體外透皮性能的較理想的方法。

阿達(dá)帕林；透皮吸收；高效液相色譜法

阿達(dá)帕林（Adapalene，CD271）是一種新的萘甲酸衍生物，屬第三代維A酸類藥物，與維A酸相比其基本分子結(jié)構(gòu)已被廣泛修飾。外用制劑為0.1%阿達(dá)帕林凝膠具有較好的抗炎，改善表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（角朊細(xì)胞）的分化能力，臨床顯示對(duì)痤瘡有良好療效，尤其適用于輕、中度痤瘡的治療[1]，較其他維A酸有更好地耐受性和更低的毒副作用[2]。因此準(zhǔn)確有效地測(cè)定阿達(dá)帕林外透皮量具有重要意義，本研究建立了透皮接受液中阿達(dá)帕林的HPLC測(cè)定方法，研究了阿達(dá)帕林的體外透皮吸收情況，為臨床使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HH型恒溫電熱水浴器（上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司）；HJ-5多功能磁力攪拌器（金壇市金祥龍電子有限公司）；改良的Franz立式擴(kuò)散池[3]；戴安P680型高效液相色譜儀；ALC-110.4型電子天平（ACCULAB）。

1.2 試樣

市售阿達(dá)帕林凝膠（法國(guó)高德美藥業(yè)股份有限公司），批號(hào)：9051033；自制阿達(dá)帕林凝膠；0.9%NaCl水溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；四氫呋喃（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；阿達(dá)帕林對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

1.3 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用小型巴馬香豬：普通級(jí)，健康，雄性，2個(gè)月，體重5.8 kg，由重慶宗申醫(yī)達(dá)生物技術(shù)研發(fā)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Global C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-四氫呋喃（86∶9∶5）（用三氟醋酸調(diào)節(jié)pH值到3.5）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱定阿達(dá)帕林對(duì)照品30.08mg置于1 000mL容量瓶?jī)?nèi)，加生理鹽水溶解并稀釋至刻度，即得濃度為30.08μg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3專屬性試驗(yàn)

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL置于50 mL容量瓶中，加生理鹽水-無(wú)水乙醇（50∶50）溶解并稀釋至刻度，即為濃度為1.203 2μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 樣品溶液的制備

稱取約為0.5 g的阿達(dá)帕林凝膠，將其均勻涂布于固定在Franz擴(kuò)散池的豬皮上，12 h后取適量接收液通過(guò)孔徑為0.45μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

2.3.3 空白基質(zhì)液的制備

分別取上述對(duì)照品溶液、樣品溶液、空白基質(zhì)液各20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

結(jié)果表明在此色譜條件下，空白基質(zhì)不會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生影響，且空白基質(zhì)在阿達(dá)帕林主峰處無(wú)吸收峰，故對(duì)阿達(dá)帕林的含量測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各2、1、2、2、3、2 mL分別至250、100、100、50、50、25mL的量瓶中，加生理鹽水溶解搖勻并稀釋至刻度，得到一組濃度分別為0.240 64、0.300 80、0.601 60、1.203 20、1.804 80、2.406 40μg/mL的對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣20μL，以濃度C（μg/mL）對(duì)峰面積A進(jìn)行回歸，得阿達(dá)帕林標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=1.031 88C-0.042 7（r=0.999 9），表明阿達(dá)帕林濃度在0.189～2.268μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果阿達(dá)帕林峰面積的RSD=0.82%。表明本方法測(cè)定阿達(dá)帕林的RSD值小于15%，在規(guī)定的范圍內(nèi)，說(shuō)明本測(cè)定方法的重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由大學(xué)生對(duì)外賣(mài)服務(wù)的滿意情況與對(duì)市場(chǎng)未來(lái)前景觀點(diǎn)的交叉圖（見(jiàn)圖2）可以看出，隨著調(diào)查對(duì)象滿意程度的加強(qiáng)，他們對(duì)共享經(jīng)濟(jì)在未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)的樂(lè)觀度也隨之加強(qiáng)．

2.6.1 室溫條件將12 h樣品接收液于室溫下存放24 h，分別于0、4、6、8、12、24 h量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察透皮接收液在室溫條件下存放的穩(wěn)定性，記錄結(jié)果：平均峰面積為0.843 7，RSD為1.41%。結(jié)果表明：透皮接收液在室溫條件下存放24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.2 冷藏（4℃）條件將12 h樣品接收液于冷藏（4℃）條件下存放7 d，分別于第1、2、3、4、5天同一時(shí)間量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察透皮接收液在冷藏（4℃）條件下存放的穩(wěn)定性，記錄結(jié)果：平均峰面積為0.847 6，RSD為0.81%。結(jié)果表明：透皮接收液在冷藏（4℃）條件下存放5 d穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05、0.10、0.15 mL分別加入至空白接收液中，每種濃度各3份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

低、中、高3種濃度回收率的平均值（99.93%）在85%～115%的范圍內(nèi)，表明本測(cè)定方法的準(zhǔn)確度高。因此，筆者所選擇的HPLC法適用于對(duì)阿達(dá)帕林透皮吸收的研究。

2.8 體外透皮實(shí)驗(yàn)[4]

2.8.1 體外皮膚的制備將巴馬香豬用電動(dòng)剪毛刀剪去腹部皮膚毛，12 h后處死，剝離皮膚（去毛部位），刮去皮下脂肪組織后用生理鹽水沖洗干凈，置于生理鹽水中浸泡約30min，

取出，用濾紙吸干備用。為了盡量消除不同部位動(dòng)物皮膚可能導(dǎo)致的誤差。將每塊皮膚隨機(jī)分成兩半，一半用于市售凝膠透皮，另一半用自制凝膠透皮。

2.8.2透皮擴(kuò)散裝置采用改進(jìn)的Franz立體擴(kuò)散裝置，接受遞質(zhì)體積為14 mL，有效釋藥面積為4.7 cm2，（37±0.5）℃恒溫，攪拌速度為300 r/min。

2.8.3 實(shí)驗(yàn)步驟將處理好的離體豬皮固定在于Franz立體擴(kuò)散池上，角質(zhì)層朝上，以皮膚恰好與液面接觸為好，將阿達(dá)帕林凝膠（約0.5 g）均勻涂布在豬皮上，在接收池中加生理鹽水14mL，用磁力攪拌器恒速攪拌接受液，使藥物自然釋放，保持恒溫水浴。分別于涂布后0.5、1、2、4、6、8、12 h定時(shí)取接受液1 mL，取樣后即向接受室內(nèi)補(bǔ)充1mL生理鹽水。用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定，按下列公式[5]計(jì)算單位面積累積滲透量（Qn）：

式中Vo為接收液總體積，V為取樣量，qn為第n次實(shí)測(cè)單位面積滲透量（qn=樣品峰面積×對(duì)照品濃度×接收液取樣量/（對(duì)照品峰面積×釋放面積），qi為第n次前每次測(cè)得的單位面積滲透量。各時(shí)間點(diǎn)藥物單位面積累計(jì)滲透量見(jiàn)表1。以單位面積平均累積滲透量對(duì)時(shí)間進(jìn)行線性回歸，擬合所得直線斜率即透皮速率（J）[6]。

2.8.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)藥物單位面積累計(jì)滲透量見(jiàn)表2；以單位面積累積滲透量對(duì)時(shí)間進(jìn)行線性回歸，所得直線斜率即透皮速率（J），結(jié)果見(jiàn)表3；對(duì)自制和市售兩處方的平均累積滲透量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 兩處方的藥物單位面積累積滲透量（μg）

表3 兩種樣品單位面積累積滲透量（Q）及透皮速率分析

表4 兩種樣品平均累積滲透量的方差分析

結(jié)果表明，我公司生產(chǎn)的阿達(dá)帕林凝膠與原研廠家生產(chǎn)的阿達(dá)帕林凝膠在相同的擬定試驗(yàn)條件下，2 h之前的透皮接收液均未檢出阿達(dá)帕林；7個(gè)取樣點(diǎn)的平均滲透量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明兩者的安全性和有效性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。阿達(dá)帕林的累積滲透量與滲透時(shí)間呈良好的線性關(guān)系，表明阿達(dá)帕林的經(jīng)皮滲透符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

3 討論

3.1 雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

在體外皮膚滲透實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物皮膚中的蛋白質(zhì)的脫落或溶解不僅會(huì)污染接受液而且本身可能會(huì)有紫外吸收，在本研究中，波長(zhǎng)270 nm處沒(méi)有任何干擾主藥測(cè)定的物質(zhì)存在，因此，筆者采用檢測(cè)靈敏度較高的的HPLC測(cè)定吸收液中的阿達(dá)帕林的含量，排除了干擾，得到了基線分離，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。

3.2 接收液的處理

本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的的Franz立體擴(kuò)散裝置考察阿達(dá)帕林凝膠體外透皮量，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。為防止由于豬皮中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大量生物大分子在接收液中溶出影響檢測(cè)結(jié)果、污染色譜柱，因此在進(jìn)行HPLC檢測(cè)之前必須對(duì)接收液進(jìn)行過(guò)濾。

3.3 試驗(yàn)皮膚的選擇

研究藥物的透皮吸收最理想的方法是對(duì)人體做實(shí)際的研究。但人體皮膚難以獲得，且價(jià)格昂貴，因而應(yīng)用動(dòng)物皮膚進(jìn)行透皮吸收研究具有實(shí)際意義。據(jù)報(bào)道豬與人的皮膚組織結(jié)構(gòu)很相似，上皮修復(fù)再生，皮下脂肪層也相似，而且實(shí)驗(yàn)證明2～3月齡的小豬皮膚解剖生理特點(diǎn)最接近于人[7]，所以選擇小豬皮膚作為透皮吸收研究模型是較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

3.4 自制阿達(dá)帕林凝膠的透皮性能

接受液中阿達(dá)帕林的含量測(cè)定結(jié)果表明，阿達(dá)帕林的累積滲透量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，以Q對(duì)t進(jìn)行線性回歸，說(shuō)明其累積滲透量Q與t線性相關(guān)性較好。由測(cè)定結(jié)果可以看出，自制和市售凝膠的相關(guān)系數(shù)、透皮速率及12 h累積滲透量均非常平行，具有可比性。兩者的平均累積滲透量的方差分析結(jié)果顯示它們的平均累積滲透量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），即兩者透皮現(xiàn)象基本一致，表明兩者的治療效果相當(dāng)。

[1]劉磊，張玉萍.阿達(dá)帕林凝膠治療輕、中度痤瘡療效觀察[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2006，1（4）：66-67.

[2]張錫寶，趙辨.阿達(dá)帕林（Adapalene）—治療痤瘡的新藥[J].中華皮膚科雜志，1999，28（12）：132

[3]丁承瑛，陸莉萍，王祥發(fā).促進(jìn)劑對(duì)雙氯芬酸貼片的透皮釋放作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，1998，18（5）：216.

[4]朱曉亮，李國(guó)鋒，曾抗，等.利多卡因納米乳制備及體外經(jīng)皮吸收的實(shí)驗(yàn)研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（3）：451-454.

[5]王暉，高麗麗，徐銘，等.磷酸川芎嗪的體外透皮吸收[J].中草藥，2000，31（2）：117-119.

[6]翟光喜，王唯紅，陳曉，等.雌二醇軟膏體外透皮吸收的研究[J].山東醫(yī)藥工業(yè)，2001，20（6）：1-2.

[7]Bhatti AS，Scott RC.In-vitro percutaneos absorption：pig epidermal membrame as amoder for human skin[J].Pharm Pharmacol，1988，40（suppl）：45.

Determ ination of percutaneous absorption of Adapalene from Adapalene Gel by HPLC

XIAO Xuecheng CHEN Feng LIDan LIJin
College of Pharmacy,HubeiUniversity of Chinese Medicine,Hubei Province,Wuhan 430065,China

ObjectiveTo establish an HPLCmethod for quantitative determination of Adapalene in vitro percutaneous solution,and investigate the ability of percutaneous penetration of Adapalene Gel.MethodsGlobal C18column(250 mm× 4.6mm,5μm)was used as the fixed phase and amixture ofmethanol,purification water and tetrahydrofuran(86∶9∶5)as a mobile phase.The flow rate was 1.0mL/min.The detection wavelength was at 270 nm.Improved Franz type diffusion cells were used in vitro permeation studies and excised minipigs skins in vitro were used as transdermal barrier.The concentration of Adapalene in the receptor solution was determined by HPLC to investigate its cumulative permeation quantities at different time respectively and compared with that of the commercial gel.ResultsThe regression equation of Adapalene was linear in the range of 0.189-2.268μg/mL(A=1.031 88C-0.042 7,r=0.999 9).The average recovery was 99.93%.A good linear relationship existed betwen the cumulative penetration quantities and the time.There was no significant difference in the permeation quantities between the self-made and commercial gel.ConclusionThe method is simple,rapid, and accurate.It is a bettermethod to evaluate the characteristic of permeation for Adapalene.

Adapalene;Percutaneous absorption;HPLC

R927.2

A

1673-7210（2012）11（c）-0120-03

2012-07-06 本文編輯：衛(wèi)軻）